Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Аминокислоты
Ь-аргинин-НС1 84,00
L-цистеин 48,00
L-глутамин 580,00
Глицин 30,00
Ь-гистидин-НС1-Н20 42,00
L-изолейцин 105,00
L-лейцин 105,00
Ь-лизин-НС1 146,00
L-метионин 30,00
L-фенилаланин 66,00
L-серин 42,00
L-треонин 95,00
L-триптофан 16,00
L-тирозин 72,00
L-валин 94,00
Витамины
D-пантотенат кальция 4,00
Холинхлорид 4,00
Фолиевая кислота 4,00
i-инозитол 7,20
Никотинамид 4,00
Пиридоксаль НС1 4,00
Рибофлавин 0,40
Тиамин НС1 4,00
') Комментарии по поводу чистоты воды, забуфериваиия среды,
добавления антибиотиков и сыворотки см. в тексте.
27—196
418
Глава 6
и растворяйте их раздельно, перед тем как смешивать в нужной пропорции. После тщательного перемешивания компонентов измерьте pH среды. Среда DMEM должна иметь pH в интервале 7,5—7,7; в атмосфере 10% С02 этот показатель устанавливается в интервале 7,3—7,4. Для успешной трансфекции величина pH среды очень важна. Для среды DMEM оптимум pH составляет как раз 7,3—7,4. Довести pH до этой величины можно также, добавив в среду Нерев-буфер pH 7,2 до концентрации 50 мМ. Стерилизуют среды фильтрованием, пропуская раствор через стерильный фильтр (размер пор — 0,2 мкм) в специальной стерильной комнате или в ламинарном боксе. Хранят среды герметично закрытыми. Непосредственно перед использованием добавляют сыворотку, пенициллин (100 мкг/мл) и стрептомицин (100 мкг/мл). Обычно для культур клеток используют бычью фетальную сыворотку.
4.1.2. Трипсин
Трипсин применяют для выделения клеток из монослоев, как описано в разд. 4.2.1. Используют 0,025%-ный раствор трипсина в физиологическом солевом растворе. Обычно бывает удобно приготовить 10-кратный раствор и разбавлять его перед использованием. Работайте только с тем трипсином, который имеет квалификацию «для культур тканей» (tissue culture grade). Некоторые клетки легче субкультивировать, если использовать раствор трипсина с ЭДТА (рабочий раствор содержит 0,5 г трипсина и 0,2 г ЭДТА на 1 литр физиологического раствора).
4.1.3. Солевой раствор на основе фосфатного буфера (PBS)
PBS используется в качестве изотонического раствора для промывки клеток. 10-кратный раствор содержит 80 г NaCl, 20 г КС1, 15 г Na2HP04 и 20 г КН2Р04 в 1 л воды.
4.2. Субкультивирование клеток из монослойной культуры
Когда клетки по мере роста и деления заполняют почти всю поверхность культурального сосуда или камеры, говорят, что сформировался полный монослой. Клетки, которым свойствен феномен контактного торможения, перестают расти, как только их плотность оказывается достаточной для контакта соседних клеток друг с другом. Клетки, не подверженные контактному торможению, продолжают делиться и формируют плотные участки трехмерного роста или фокусы. Для экспериментов по переносу генов клетки следует субкультивировать на стадии, предшествующей формированию полного монослоя, то есть до того
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих
419
.момента, когда их рост начнет замедляться вследствие контактного торможения. Субкультивирование подразумевает выделение клеток из монослоя путем трипсинизации, подсчет их количества и пересев при более низкой плотности.
4.2.1. Трипсинизация клеток
Подогрейте все растворы на водяной бане до 37 °С. Удалите из культурального сосуда с клетками среду культивирования и добавьте раствор (IX) трипсина (для чашки диаметром 9 см достаточно 1 мл, для 25 см2 флакона — 0,5 мл). Поместите клетки обратно в термостат на 37 °С. Через 1—2 мин осмотрите клетки под микроскопом — они должны округлиться и обособиться друг от друга. Теперь их можно легко снять с подложки, слегка встряхнув чашку. Если при этом клетки не отделяются от поверхности сосуда, снова поместите их в инкубатор и подождите минуту-другую. Когда все клетки отделятся от субстрата, остановите трипсинизадию, добавив 0,5—1 мл среды DMEM, содержащей 10% сыворотки. На этой стадии лучше клетки перенести в стерильную пробирку на 50 мл. Добавьте среду до объема исходной культуры. Если клетки выращивали на 9-см чашке, доведите объем до 10 мл. Теперь клетки можно сосчитать и пересеять.
