Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Следует, однако, иметь в виду, что индуцирующие стимулы могут так или иначе влиять на нормальные внутриклеточные процессы. Наиболее ярко это проявляется в случае индукции с помощью теплового шока, поскольку большинство клеточных генов также находится под контролем — позитивным или негативным— этого управляющего стимула. В определенной степени это справедливо и для индукции металлотионеиновых генов мыши или человека ионами тяжелых металлов. Пожалуй, несколько более высокую специфичность обнаруживает стимуляция транскрипции с помощью контролирующих элементов, работающих «в паре» со стероидами. Эти элементы присутствуют в промоторе металлотионеинового гена человека (но не мыши), а также в промоторах MMTV и гормона роста. Подводя итог сказанному, необходимо подчеркнуть, что исследователь должен выбирать вектор, исходя из поставленной задачи и конкретной цели эксперимента. Контролирующие элементы любого вектора можно заменить или модифицировать согласно этим целям.
414
Глава 6
2.4. Векторы для временной экспрессии и для стабильной трансформации
При переносе генов в клетки млекопитающих обычно используются два экспериментальных подхода. Временная экспрессия позволяет анализировать генный продукт — РНК или белок — в течение нескольких часов после проникновения ДНК в клетку. Плазмидные векторы способны функционировать в ядре, не интегрируясь в клеточный хроматин, в течение 80 ч. Снискали популярность подобные векторы, кодирующие такие маркерные белки, которые либо не свойственны клеткам млекопитающих, либо легко детектируются на общем фоне хозяйских белков. Этот методический прием позволяет провести быстрый скрининг трансформантов на экспрессию генов, заключенных в плазмиде. В качестве маркерных генов для эукариотических экспрессирующих векторов широко используются различные бактериальные гены. В частности, две наиболее распространенные эукариотические системы временной трансформации основаны на использовании двух бактериальных генов — гена хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) и гена lacZ Е. coli, кодирующего fi-галактозидазу. Обычно в качестве вектора для осуществления временной экспрессии используют производные pSV2, несущие какой-нибудь из этих генов. (Все векторы семейства pSV2 имеют идентичную последовательность нуклеотидов в области 1—4127 — см. последовательность pSV2cat в приложении. В векторе pSV2cat область 4128—5003 кодирует ген CAT.) Методы определения продуктов каждого из указанных генов подробно обсуждаются в разд. 7.1 и 7.2.
Две наиболее популярные векторные системы для стабильной трансформации предполагают использование доминантных селективных маркеров — бактериальных генов, продукты которых -синтезируются de novo в культивируемых клетках млекопитающих и обеспечивают этим клеткам селективное преимущество. Такими маркерами служат гены Е. coli пеоя или gpt. Подробное -обсуждение соответствующих методик приводится в разд. 8.2 и 8.3.
3. Приготовление ДНК
Помимо хорошего «самочувствия» клеток (см. разд. 4) важным фактором, влияющим на успех эксперимента, является состояние плазмидной ДНК Целесообразно проверить препараты .ДНК электрофоретически (не содержат ли они РНК и хромосомную ДНК). Необходимо и дальше периодически проверять препараты, чтобы быть уверенным, что плазмидная ДНК находится в сверхспирализованной форме. Рекомендуем также дважды отцентрифугировать ДНК в градиенте плотности хлористого цезия. Известно множество методов выделения плазмидной
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих
415"’
ДНК, однако, на наш взгляд, наиболее стабильные результаты при высоком качестве ДНК обеспечивает метод лизиса бактерий Тритоном. Соответствующие экспериментальные процедуры, описаны в табл. 1.
Таблица 1. Получение плазмидной ДНК
1. Из отдельной бактериальной колонии, содержащей плазмиду, нарастите при 37 °С 5 мл ночной культуры. Внесите эту культуру в 800 мл супербульона1) и инкубируйте при 37 °С в течение 36 ч при интенсивном встряхивании.
2. Осадите бактерии центрифугированием при 4°С в роторе Sor-vall G30 (или эквивалентном) при 5000 об/мин в течение 10 мин.
3. Ресуспендируйте осадок в 100 мл ТЕ2> и снова центрифугируйте в том’ же режиме. На этой стадии бактериальный осадок можно хранить при; —20 °С.
4. Ресуспендируйте осадок на льду в 9 мл TES3); суспензию тщательно' перемешайте.
5. Добавьте 0,9 мл раствора лизоцима в TES (10 мг/мл) и инкубируйте-на льду в течение 5 мин.
6. Добавьте 3,7 мл 0,25 М ЭДТА pH 8,0; инкубируйте на льду в течение 5 мин.
7. Добавьте 14,5 мл охлажденного раствора Тритона4). Перемешайте № оставьте на льду на 10 мин.
8. Центрифугируйте при 4°С в роторе SW27 (или эквивалентном) при 25 000 об/мин в течение 30 мин.
9. Надосадочную жидкость перенесите в полипропиленовую пробирку на 50 мл и добавьте такое количество буфера ТЕ, чтобы вес препарата достиг 30,17 г. Добавьте 28,14 г CsCl и тщательно перемешайте. Добавьте 4,5 мл; раствора этидиумбромида (10 г/мл) в 10 мМ трис-НС1 pH 7,5.
