Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2. На второй день замените среду культивирования свежей средой, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки. Через 3 ч после этого добавляют ДНК.
3. Приготовьте кальций-фосфатный преципитат ДНК, используя запасные растворы, подогретые до комнатной температуры. Для флакона 25 см2, содержащего 5 мл среды, понадобятся следующие растворы. В пробирку А внесите раствор, содержащий 5 мкг ДНК, затем 31 мкл 2М СаС12 и доведите суммарный объем водой до 0,25 мл. В пробирку Б внесите
0,25 мл 2х HBS. Для получения преципитата содержимое пробирки А смешивают с HBS в пробирке Б. Такой порядок действий имеет принципиальное значение. Раствор ДНК по каплям
422
Глава 6
добавляют к HBS. Преципитат формируется немедленно. Если он выглядит плотным и непрозрачным (должен выглядеть полупрозрачным), значит pH приготовленного HBS не тот, который требуется.
4. Нанесите преципитат на клетки, слегка наклоняя чашку и добавляя его в среду. Немедленно поставьте клетки обратно в термостат, чтобы pH не изменился.
5. Инкубируйте клетки в течение 3,5—4 ч.
6. Осмотрите образовавшийся преципитат. В идеале он напоминает мелкие гранулы, которые покрывают наружную поверхность клеток. Если pH среды слишком кислый, преципитат не образуется; при защелачивании среды формируется грубодисперсный флотирующий преципитат. Характер преципитата также сильно зависит от состояния ДНК (см. разд. 3).
7. Промойте клетки средой без сыворотки. Чтобы повысить эффективность трансфекции на этой стадии, можно подвергнуть клетки глицериновому шоку. Для этого добавьте во флакон с клетками 0,5 мл 15%-ного раствора глицерина в HBS и инкубируйте при 37°С. Оптимальное время инкубации в зависимости от типа клеток составляет от 30 сек до 3 мин. Так, например, клетки NIH/3T3 и CV1 надо инкубировать 2 мин, а клетки HeLa — 30 сек. «Шок-раствор» необходимо удалить до того момента, когда клетки начнут сжиматься. Затем клетки отмывают и заливают свежей средой.
8. На 4-й день клетки собирают и проводят тест на экспрессию, как описано в разд. 7.
5.3. Варианты основной методики
5.3.1. Длительный контакт клеток с кальций-фосфатным преципитатом
Описан и широко применяется вариант методики, предполагающий длительное — в течение 18 ч — инкубирование клеток с кальций-фосфатным преципитатом. По истечении времени инкубации преципитат тщательно отмывают и клетки заливают свежей средой. В этом случае добавление глицерина оказывается менее эффективным с точки зрения повышения эффективности экспрессии трансформированной ДНК (по данным теста на временную экспрессию, см. разд. 7).
5.3.2. Обработка клеток бутирагом
Обработка клеток после трансфекции бутиратом увеличивает количество клеток, способных экспрессировать чужеродную ДНК, по меньшей мере в три раза. Это означает, что число клеток в популяции, дающих положительный сигнал в тесте
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих
423
на временную экспрессию, может достигать 40% [12]. Кроме того, обработка бутиратом может специфически повышать транскрипционную активность целого ряда плазмид, в состав которых входят контролирующие генетические элементы вирусов SV40, полиомы или папилломы. Методика не отличается от той, которая изложена в разд. 5.2, вплоть до стадии 7. После глицеринового шока к клеткам добавляют свежую среду и затем раствор бутирата натрия. В этом растворе клетки оставляют на ночь. На следующее утро бутират удаляют, клетки промывают и заливают свежей средой. Требуемая концентрация бутирата зависит от типа клеток: так, к клеткам CVI добавляют 10 мМ раствор, к NIH/3T3 и HeLa — 5 мМ, а к СНО (клеткам яичника китайского хомячка)—2 мМ раствор бутирата. Удобнее всего пользоваться концентрированным (0,5 М.) запасным раствором бутирата натрия, приготовленным одним из следующих способов.
1. Возьмите 1,5 мл масляной кислоты (мол. масса 88) и добавляйте раствор NaOH, пока pH раствора не достигнет 7,0. Доведите объем до 25 мл и простерилизуйте раствор фильтрованием.
2. Растворите в воде 1,375 г бутирата натрия (мол. масса 109), доведите pH раствора до 7,0; конечный объем раствора — 25 мл. Стерилизуйте фильтрованием.
Чтобы получить 10 мМ раствор, добавьте 200 мкл концентрированного раствора в 10-см чашку, содержащую 10 мл среды.
5.3.3. Обработка хлорохином
Обработка хлорохином также используется для повышения эффективности трансформации [13]. Поскольку этот метод можно применять как с кальций-фосфатной методикой, так и с ДЕАЕ-декстрановой процедурой, мы обсудим его позднее.
6. ДЕАЕ-декстрановый метод
Эта методика нашла широкое применение для увеличения эффективности инфицирования клеток вирусами. Через некоторое время была разработана модифицированная процедура, позволяющая с высокой эффективностью вводить в клетки и плазмидную ДНК [14]. Следует, однако, подчеркнуть, что с помощью данного метода не удается получать стабильно трансформированные клеточные линии. Вместе с тем он весьма удобен для осуществления временной экспрессии и с успехом использовался не только в работе с монослойными клеточными культурами, но и для трансфекции лимфоцитов [15].
