Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 182

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 176 177 178 179 180 181 < 182 > 183 184 185 186 187 188 .. 253 >> Следующая

Довольно часто мухи поколения Go, подвергнутые инъекции Р[п/]-ДНК, имеют фенотип, промежуточный между гу и гу+. Подобная «Go-экспрессия» гу может служить указанием на то, что ДНК была успешно введена в эмбрион и ее экспрессия осуществляется надлежащим образом. Однако достоверной корреляции между Go-экспрессией гу и трансформацией зародышевого пути не наблюдается [1, 16].
7. Характеристика трансформантов
Первоочередной задачей теперь является получение линий Gi-трансформантов. Трансформированное потомство данной Go-мухи можно скрещивать между собой или с мухами хозяйской линии, чтобы вывести трансформированную родительскую линию. Как мы уже говорили, в том случае, если значительная часть потомства имеет трансформированный фенотип, велика
402
Глава 5
1вероятность того, что в геноме присутствует больше чем один Р-транспозон. Если разные сайты интеграции находятся на разных хромосомах, их будет нетрудно изолировать потом (когда не будет опасности потерять линию) путем скрещивания представителей родительской линии с мухами, несущими до-минантно-маркированные хромосомы-балансёры. Чаще, однако, в геноме присутствует единственная вставка.
Заканчивая этот раздел, нелишне напомнить, что получение трансформантов занимает значительно меньше времени, чем .характеристика и детальное изучение их биологических свойств.
7.1. Генетический.анализ
Вернемся к случаю множественной интеграции Р-элементов ти вытекающей отсюда задаче получения линий трансформантов •с единственной вставкой. Стандартные генетические скрещивания с использованием доминантно маркированных хромосом-ба-.лансёров позволяют идентифицировать и разделить разные хромосомы, несущие интегрированные P-элементы. Хромосомы-балансёры содержат множественные инверсии, которые супресси-руют их рекомбинацию с соответствующими хромосомными гомологами. Вдобавок они содержат один или несколько доминантных генетических маркеров, по которым можно отличить мух, несущих балансёры, от особей, гомозиготных по соответствующим гомологам. Примерами широко используемых балансёров могут служить: для Х-хромосомы — FM7, В (маркированный геном Ваг)\ для второй хромосомы — СуО (маркированный мутацией curly — загнутые крылья) и для третьей хромосомы — ТМЗ, Sb ser (маркированный мутациями «короткие щетинки» и «зазубренные крылья»).
Исследователь должен располагать линией со сцепленными Х-хромосомами и набором балансёрных линий для трех главных хромосом. (Хотя это условие и не является абсолютно необходимым, оно существенно облегчает дальнейший генетический анализ трансформантов.) Например, если P-элемент маркирован геном rosy дикого типа, пригодятся линии C(1)DX, yf; ryi2, линии FM7; ryi2, линии СуО; гу42 и линии ТМЗ, гу/гу*2. Отметим, что, поскольку ген гу дикого типа локализуется в хромосоме 3, понадобится балансёр третьей хромосомы, который несет мутантный ген гу. Аналогично, если в качестве маркера транспозона используется ген Adh, понадобится соответствующий балансёр второй хромосомы, например СуО.
Чтобы повысить шансы на сохранение каждого Р-транспо-зона в популяции, несколько особей родительской линии следует скрестить по отдельности с представителями каждой из балансёрных линий. Полученное потомство, несущее в геноме маркер транспозона. и тот или иной доминантный маркер балансёра, скрещивают затем с мухами хозяйской линии. Сегрегация
Таблица 1. Основные этапы получения и характеристики
трансформированных линий
Этапы Этап 1
Поколение G0
В эмбрионы хозяйской линии инъецируют смесь хелперных Р-элементов и Р-транспозонов, несущих селективный маркер
Этап 2
Поколение Go
Выживших и достигших взрослого состояния мух индивидуально скрещивают с представителями хозяйской линии, чтобы получить максимальное количество потомков
Этап 3 Поколение Gi
Потомков каждого Go-родителя анализируют (или проводят скрининг) на наличие трансформированного фенотипа. Трансформированных потомков каждого Go-родителя скрещивают друг с другом или с представителями хозяйской линии, чтобы получить трансформированные родительские линии
Этап 4
Поколение G2 и далее Родительские линии изучают путем блот-гибридизационного анализа ДНК, чтобы определить количество Р-транспозонов, присутствующих в геномах представителей каждой линии
Этап 5
Параллельно с этапом 4 представителей каждой родительской линии скрещивают с различными балансёр-ными линиями, чтобы определить, в какой хромосоме локализуется внедрившийся в геном Р-транспозон
Пример
Смесь Р[/¦(/] и pn25.7wc инъецируюг в 100 Go /'(/“-эмбрионов
Получено 20 взрослых особей; их: индивидуально скрещивают с гу42-партнерами. 10 особей оказались
фертильными и дали по несколько» сотен потомков
В потомстве двух из 10 Go-родителей обнаружены мухи гу+. В одном случае это три самца гу+ и две самки гу+\ их скрещивают между собой и получают родительскую линию А. В другом случае это единственный самец гу+, которого скрещивают с самками гу42, — получают-родительскую линию В
Предыдущая << 1 .. 176 177 178 179 180 181 < 182 > 183 184 185 186 187 188 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed