Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Иглу соединяют пластиковой трубкой с наполненным воздухом шприцем разового пользования на 25 мл. Перемещая поршень шприца, осторожно выдувают видимый объем раствора ДНК, который составляет 1—5% от объема яйца. При этом можно наблюдать, как раствор ДНК перетекает в желток. Если инъецируемый объем слишком велик, содержимое эмбриона начнет вытекать наружу после того, как игла будет удалена. Это может также служить указанием на то, что эмбрион был недостаточно высушен. Не падайте духом, если небольшое количество желтка все-таки вытекло после инъекции. Очень часто такие эмбрионы успешно развиваются в здоровых мух.
Как правило, несколько эмбрионов из тех, что закреплены на покровном стекле, к моменту инъекции дойдут в своем развитии до стадии образования бластодермы или даже до более поздних стадий. Не нужно колоть эти эмбрионы: вероятность
их трансформации мала, а шансы выжить велики. Работа же по содержанию мух и их потомства для поиска трансформантов существенно превышает по объему затраты труда на элиминацию этих неперспективных эмбрионов. По ходу инъецирования всей серии яиц отмечайте позиции неуколотых эмбрионов («переразвитых» или поврежденных). Закончив эту процедуру, пе-
400
Глава 5
ренесите покровное стекло с эмбрионами под микроскоп и удалите неуколотых эмбрионов с помощью пинцета или тонкой иглы, отметив количество оставшихся хороших яиц.
5.3. Инкубация эмбрионов после инъекции
Поместите покровное стекло с эмбрионами во влажную камеру при 18—20 °С и инкубируйте до момента выхода личинок. Практически это можно осуществить, взяв обычную чашку Петри с прикрепленной к крышке изнутри влажной фильтровальной бумагой и поместив туда стекло с эмбрионами, покрытыми маслом. Важно, чтобы чашка стояла горизонтально, иначе масло стечет и эмбрионы погибнут. Когда выведутся личинки (приблизительно через 2 дня) перенесите их пинцетом на стандартную среду для мух — примерно по десять личинок на флакон — и инкубируйте при 25°С. Без заметного вреда для себя личинки могут провести в масле несколько часов. Можно сделать и по-другому: оконтурить алмазным резцом участок покровного стекла с закрепленными эмбрионами и, обломав лишнее, поместить этот кусочек стекла в узкий желобок, выдавленный в слое корма в чашке Петри. Затем необходимо заполнить желобок маслом, чтобы предохранить эмбрионы от случайного высыхания на воздухе. Когда личинки выведутся, они легко внедрятся в слой корма. Следует, однако, попытаться собрать эти личинки, чтобы определить их число и затем перенести в более подходящий флакон со средой для мух.
6. Поиск трансформантов
Каждую взрослую муху, развивавшуюся из «уколотого» эмбриона (поколение G0), надо индивидуально скрестить с мухами хозяйской линии. Важно получить как можно более многочисленное потомство Gi, поскольку трансформанты могут попадаться не чаще, чем 1 на 200 мух. Скрещивайте каждую Go-самку с несколькими самцами и отсаживайте родителей в новые пробирки каждые 5 дней. Go-самцов скрещивайте с несколькими разными группами самок по 3—4 особи в каждой. Их также следует отсаживать каждые несколько дней. Таким образом от одной самки можно получить до 150 потомков и от одного самца — до 300.
Далее исследуют фенотип Gi-потомков. Если в качестве селективного маркера использовался ген Adh, трансформантов можно отбирать по устойчивости к 6%-ному раствору этанола [9]. Для выявления маркера пеоR потомство G] на личиночной стадии содержат на среде, в которой присутствует препарат G418 в концентрации 1 мг/мл. Подобная селекция трансформантов по лекарственной устойчивости значительно экономит
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы 401
время. При использовании в качестве маркера гена rosy мух просматривают, для того чтобы отобрать особей с фенотипом гу+. Хотя поначалу различия в цвете глаз у мух с фенотипом гу и гу+ могут показаться неочевидными, очень скоро у исследователя вырабатываются необходимые навыки и он без труда замечает даже самые малые изменения в фенотипическом выражении этого признака.
Известно, что истинные трансформанты могут обнаруживать промежуточный фенотип между гу и гу+, что объясняется интеграцией Р [гу] в транскрипционно-неактивные или гетерохроматиновые области хромосомы [5, 22]. Безусловно, эти трансформанты представляют собой научный интерес, однако при селекции по маркерам Adh или пеоR они, естественно, будут утрачены. Спрадлинг и Рубин [22] показали, что лишь очень немногие (если это вообще возможно) Р[гу]-элементы встраиваются в такие участки генома, где уровень экспрессии гена гу столь низок, что не обеспечивает трансформантам фенотипического отличия.
Доля трансформантов в Gi-потомстве одного Go-родителя может сильно варьировать. Часто удается обнаружить только одного или двух трансформантов, однако бывают и более удачные эксперименты. В редких случаях трансформанты могут составлять значительную часть всего потомства — до 50% и даже более. Можно предположить, что это результат множественной транспозиции разных P-элементов в клетки зародышевого пути «уколотой» (Go) мухи, причем в разные хромосомные локусы [8]. Однако чаще все же приходится сталкиваться с единичными актами интеграции. Поскольку транспозиция, как правило, происходит премейотически, несколько трансформированных потомков одного Go-родителя с высокой степенью вероятности могут обнаруживать идентичные сайты интеграции Р-элемента.
