Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
10. При помощи пипетки перенесите смесь в полиалломерную центрифужную пробирку с крышкой для ротора Beckman VTi50 или Ti60. Режим центрифугирования для вертикального ротора —18 ч при 45 000 об/мин » 20 °С, для ротора Ti 60—60 ч при 35 000 об/мин.
И. После центрифугирования перенесите пробирку под источник УФ-из-лучения. С помощью шприца на 20 мл с иглой № 19, проколите стенку пробирки против нижней полосы, которая соответствует плазмидной ДНК* и отберите 4—5 мл раствора из этой зоны.
12. Повторите центрифугирование в CsCl (см. п. 13) или экстрагируйте-этидий изопропанолом, насыщенным CsCl в такой же концентрации, что и при центрифугировании. Затем диализуйте препарат против ТЕ, чтобы удалить CsCl, добавьте 1/10 объема 5М NaCl и два объема этанола и оставьте на ночь при —20 °С. Осадок соберите центрифугированием и высушите на воздухе, чтобы удалить следы этанола.
13. Для повторного центрифугирования приготовьте раствор CsCl в ТЕ. (1,08 г/мл). К этому раствору добавьте раствор этидиумбромида (10 мг/мл) из расчета 0,17 мл на 1 мл взятого ТЕ и заполняйте им центрифужные пробирки с препаратами плазмидной ДНК Для ротора VTi50 или VTi65.,
') Супербульон готовят нз концентрированных растворов А и Б. Раствор А содержит 120 г триптона; 240 г дрожжевого экстракта; 50 мл глицерина в 900 мл воды. Раствор Б содержит 125 г К2НРО4, 38 г КН2РО4 и воды до 1 л. Каждый раствор автокла-внруют отдельно и затем смешивают в отношении А:Б=9:1; pH суммарного раствора должен быть 7,2.
2) ТЕ: 10 мМ трис-НС1 pH 7,9; 1 мМ ЭДТА.
3) TES; 50 мМ трис-НС1 pH 7,5; 40 мМ ЭДТА; 25% (по весу) сахароза.
*) Раствор Тритона приготавливают, смешивая 1 мл 10% Тритона; 31,5 мл 25 мМ. ЭДТА; 5 мл 1 М трис-НС1 pH 7,9 и 62,5 мл воды; готовый раствор стерилизуют фильтрованием.
416
Глава 6
4. Культивирование клеток
Независимо от выбранной методики эксперимента в первую очередь следует детально изучить ростовые особенности клеток, которые предполагается использовать в качестве реципиентов чужеродных генов. Хотя на первый взгляд это требование кажется само собой разумеющимся, мы акцентируем на нем внимание, поскольку важность этого этапа работы чрезвычайно велика. Условия культивирования клеток для трансфекции — самый вариабельный параметр во всей схеме эксперимента по генетическому переносу, и знание тех или иных нюансов, касающихся выращивания конкретных клеток, окажет неоценимую помощь в преодолении неожиданно возникших экспериментальных трудностей.
Не вызывает сомнения, что клетки, растущие в монослое, т. е. в виде одинарного слоя, распластанного на подложке,— наиболее подходящий объект для трансфекции. Такие клетки проще использовать в эксперименте, чем клетки, культивируемые в суспензии. Охарактеризованные стабильные клеточные линии предпочтительнее свежих эксплантатов-—так называемых первичных культур. Это связано с тем, что первичные клетки не адаптированы к росту in vitro и их ростовой цикл в культуре с течением времени сильно замедляется. В то же время наблюдается строгая корреляция между скоростью роста культуры и способностью клеток акцептировать ДНК. Поэтому мы рекомендуем начинать эксперименты по генетическому переносу с такими стабильными клеточными линиями, как человеческие клетки HeLa (рак шейки матки, эпителиальный тип), мышиные фибробласты ЗТЗ или ЗТ6 или же клетки печени мыши, известные как L-клетки.
4.1. Растворы для культивирования клеток 4.1.1. Среды
Для трансфекции используют различные среды; пожалуй, более других распространена модифицированная Дульбекко среда Игла (DMEM) —ее состав приведен в табл. 2. Единственное ограничение, касающееся использования сред, следующее: любая среда, содержащая СаС12 (например, среда RPMI), непригодна для трансфекции кальций-фосфатным методом. Избыток кальция приведет к образованию плотного осадка. Для приготовления сред следует брать только бидистиллят. Лучше, если предварительно вода была деионизована. Обязательно охладите воду после дистилляции и лишь затем приступайте к приготовлению сред. pH дистиллированной воды должен быть приблизительно 5,5. Используйте только высокочистые вещества
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих
417
Таблица 2. Среда Игла в модификации Дульбекко‘>
Компоненты мг/мг
Соли
CaCh (безводный) 200,00
Fe(N03)3-9H20 0,Ю
КС1 400,00
MgS04-7H20 200,00
NaCl 6400,00
NaHC03 3700,00
NaH2P04-H20 125,00
Другие компоненты
Глюкоза 4500,00
Феноловый красный 15,00
