Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
4.2.2. Подсчет клеток
Клетки подсчитывают для того, чтобы отобрать для субкультивирования точно известное их количество. В экспериментах по трансфекции это очень важно, так как в момент контакта с ДНК клетки должны находиться в логарифмической фазе роста. Для большинства клеток, культивируемых в монослое, при использовании в экспериментах по трансфекции рекомендуемая . плотность культуры должна составлять 3— 5-105 клеток на чашку диаметром 9 см или приблизительно 104/см2. Если у вас есть счетчик клеток Coulter, не составляет труда научиться им пользоваться. Если же подобного прибора нет, для подсчета клеток можно воспользоваться гемоцитомет-ром. Метод заключается в подсчете под микроскопом количества клеток в очень малом объеме. Гемоцитометр представляет собой предметное стекло с нанесенными на него в виде прямоугольной сетки штрихами, ограничивающими различные по размеру квадраты поверхности. Между этим стеклом и накладываемым сверху покровным стеклом обеспечивается постоянный зазор в 0,1 мм. Этот зазор легко заполняется суспензией клеток благодаря действию капиллярных сил. Клетки в каждом квадрате подсчитывают под микроскопом с помощью ручного счетчика. Зная площадь квадрата и, следовательно, соответствую-
27*
420
Глава 6
щий ему объем клеточной суспензии, нетрудно вычислить концентрацию клеток в данной суспензии. Гемоцитометр имеет девять больших квадратов.
А В А
В С В
А В А
При условии, что камера заполнена правильно, каждому большому квадрату соответствует объем 10~4 мл. Итак, отберите небольшую каплю однородной клеточной суспензии. Это удобно сделать при помощи пастеровской пипетки. Аккуратно заполните суспензией пространство между предметным и покровным стеклами, так чтобы излишек жидкости не попал на наружную поверхность стекол. (Помните о том, что пипетка более не стерильна и ее нельзя использовать повторно.) Обычно подсчитывают число клеток в квадратах С и В и полученные величины усредняют. Затем это количество умножают на 104, чтобы получить число клеток в 1 мл среды. Теперь можно легко рассчитать фактор разведения, чтобы получить культуру требуемой плотности. Для обычного субкультивирования большинство клеток высевают при плотности 0,5—1,0-105 клеток на 9-см чашку (приблизительно 103 клеток/см2). Для экспериментов по трансфекции клетки следует высевать при несколько более высокой плотности, чтобы они находились в логарифмической фазе роста. Как правило, эта величина составляет 5-105 клеток на 9-см чашку или IOVcm2. Если высеять клетки при указанной плотности, большинство культур формирует полный монослой через 4—7 дней культивирования. Желательно записывать количество пассажей каждой линии клеток. Данный параметр удобно регистрировать, если включить это изменяющееся число в обозначение клеток. При многократном субкультивировании способность клеток захватывать ДНК — как плаз-мидную, так и вирусную — может изменяться. Для большинства экспериментов по трансфекции пригодны клетки, прошедшие не более 15 циклов последовательного субкультивирования.
5. Кальций-фосфатный метод
Это наиболее широко используемый метод [11]. Его можно с успехом применять для большинства клеток в монослойной культуре и для ряда клеток, культивируемых в суспензии. Кальций-фосфатный метод весьма эффективен как для осуществления временной экспрессии, так и для стабильной трансформа-
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих
421
дни клеток. Универсальность методики сделала ее весьма популярной. Однако следует заметить, что здесь несколько труднее выявить параметры, которые наиболее важны с точки зрения успешного проведения эксперимента, чем в ДЕАЕ-декстрановом методе.
5.1. Растворы для кальций-фосфатного метода
1. Солевой раствор с Hepes-буфвром (HBS). 10X раствор содержит 8,18% NaCl (по весу), 5,94% Hepes (по весу) и 0,2% Na2HP04 (по весу); его разливают по 50 мл и хранят при 4°С. Сухой Hepes для приготовления этого раствора лучше всего хранить обезвоженным при 4°С. Для работы приготовьте из 10Х запасного раствора 2х HBS, доведите pH до 7,12 1 н NaOH и простерилизуйте фильтрованием через нитроцеллюлозную мембрану. HBS следует готовить тщательно и аккуратно, поскольку величина pH имеет принципиальное значение для эффективной трансфекции.
2. 2М CaCl-i. Раствор стерилизуют фильтрованием через нитроцеллюлозную мембрану и хранят при 4°С.
3. 15% глицерин!HBS приготавливают, смешивая 30 мл 50% глицерина (по весу), 50 мл 2х HBS (pH 7,12) и 20 мл воды. Раствор стерилизуют фильтрованием и хранят при 4°С.
5.2. Основная методика
Известно много вариантов методики с использованием фосфата кальция. Мы приводим две наиболее распространенные методические разработки. Целесообразно опробовать каждую из них на конкретной линии клеток. Такое предварительное тестирование можно провести с использованием одной из систем временной экспрессии, которые описаны в разд. 7.
1. За день до постановки эксперимента по трансфекции (1-й день) пересейте клетки при плотности 104/см2.
