Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Не стоит, однако, стремиться получить эту информацию в первую очередь. На наш взгляд, целесообразнее вначале выделить линию с единичной вставкой и провести детальный блот-гибридизационный и сегрегационный анализ.
406
Глава 5
8. Факторы, влияющие на успех эксперимента
8.1. Эффективность трансформации
Согласно опубликованным данным, в популяции переживших; инъекцию взрослых фертильных особей (G0) доля трансформантов варьирует от 1—2% До 50% {1, 3, 7, 9, 10, 16, 2^],; в среднем эта величина составляет около 10%. Обсуждается, целый ряд условий, так или иначе влияющих на частоту трансформации, однако систематический анализ соответствующих параметров в большинстве случаев не проводился. Перечислим некоторые из них.
1. Количество вводимой ДНК. Слишком большое количество-хелперных P-элементов, по-видимому, ингибирует трансформацию [2].
2. Количественное соотношение дефектных рекомбинантов и: хелперных элементов (см. разд. 4.6).
3. Размер рекомбинантной конструкции на основе Р-транс-позона.
4. Характер нуклеотидных последовательностей, присутствующих в данной конструкции. Имеются указания на то, что-крупные P-элементы транспозируются с более низкой частотой. Однако это нельзя считать общим правилом, поскольку известно много примеров, когда транспозоны сходного размера трансформируют объект с разной эффективностью. Теоретически ограничений на размер Р-транспозона не существует. На практике наиболее крупный из известных на сегодняшний день вариант P-элемента, который был успешно использован в экспериментах по трансформации, имел размер 54 т.п.н. [16].
Успех эксперимента во многом зависит и от таких факторов, которые трудно учесть количественно. К их числу относится уровень индивидуальной подготовки экспериментатора, в частности, в какой степени он владеет необходимыми техническими навыками. Несмотря на то что в ранних работах [1, 16] часта фигурировала цифра 50% трансформантов (среди выживших взрослых особей), в последующих экспериментах далеко не всегда удавалось достичь столь высоких результатов.
8.2. Частота выживания
Обычно лишь около 15% «уколотых» эмбрионов выживает и достигает стадии половозрелой особи. Потери возможны на любом этапе развития. Так, например, по сообщениям Хейзел-ригга [3], из 3500 эмбрионов, подвергнутых инъекции, 40% превратилось в личинки, из них 50% достигло взрослого состояния и из этих последних 65% оказались плодовитыми. Вероятно, наиболее важными факторами, понижающими жизне-
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы 407
способность и плодовитость мух, переживших инъекцию, являются подсушивание эмбриона и повреждение эмбриона иглой. У начинающих экспериментаторов наибольшее число неудач падает на эмбриональную стадию, однако положение дел быстро улучшается по мере приобретения необходимого опыта.
9. Ремобилизация Р-транспозона у трансформированных мух
Если интегрированный Р-транспозон присутствует в интакт-ной форме, он может быть снова мобилизован при условии возникновения молекулярной среды, характерной для дисгенных гибридов. Это достигается, как было описано выше, путем инъекции интактного хелперного P-элемента (например, pit25.7wc) в развивающийся зародыш; особенность здесь состоит в том, что сама хозяйская линия представляет трансформированную линию, содержащую дефектный рекомбинантный Р-элемент. Хелперный элемент обеспечивает синтез транспозазы, которая и ремобилизует интегрированный транспозон.
Хейзелригг и Левис [31] инъецировали wc-хелпер в концентрации 50—100 мкг/мл трансформированным мухам, содержащим в геноме V [white]-транспозон. В результате от 20 до 40% мух G0 дали по меньшей мере по одному потомку, обнаруживающему новый сайт интеграции Р-транспозона. Таким образом, частота ретранспозиции оказалась выше, чем средняя частота изначальной трансформации.
Техника ремобилизации Р-транспозона может оказаться полезной, например, в том случае, если необходимо переместить уже присутствующий в геноме рекомбинантный P-элемент с интересующим геном на конкретную хромосому. Эта методика пригодится и тогда, когда случайно обнаружен трансформант, фенотип которого по тем или иным признакам можно объяснить эффектом положения. Проверить такое предположение можно непосредственно: надо транспозировать Р-транспозон в другой участок генома и наблюдать за изменениями в экспрессии мобилизованного гена, которые будут сопровождать это перемещение.
Литература
1. Rubin G. М., Spradling А. С. Science, 218, 348 (1982).
2. Spradling А. С., Rubin G. М. Science, 218, 341 (1982).
3. Hazelrigg Т., Levis R. L., Rubin G. M. Cell, 36, 469 (1983).
4. Fyrberg E. A., personal communication.
5. Davies I., Delaney S., Glover D. М., personal communication.
6. Wensink P., personal communication.
7. Scholnick S. B., Morgan B. A., Hirsh J. Cell, 34, 37 (1983).
8. Wakimoto B., Kalfayan L., Spradling A., personal communication.
9. Goldberg D., Posakony J., Maniatis T. Cell, 35, 59 (1983).
