Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
[26]. Молярное соотношение 20:1 при общей концентрации ДНК 1 мг/мл позволило получить около 30% трансформантов [11]. Понятно, что отмеченная разница в эффективности трансформации не имеет решающего значения (см. также разд. 8.1).
Центрифугируйте раствор ДНК в буфере для инъекции непродолжительное время в микроцентрифуге, чтобы удалить любые частицы, способные закупорить просвет иглы. Отберите из
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы____________397
поверхностного слоя 2 мкл раствора и введите этот объем в иглу, либо используя капиллярный эффект, либо непосредственно— с помощью оттянутого микрокапилляра или микрошприца типа Hamilton. Заполненную иглу надо немедленно закрепить в микроманипуляторе и ее острие осторожно опустить в каплю масла Halocarbon, которую предварительно наносят на предметное стекло, закрепленное на столике микроскопа. Это предохранит раствор ДНК от выпаривания — в противном случае могут образоваться кристаллы соли, которые закроют просвет иглы. Если игла не сломалась и не закупорилась, ею можно пользоваться в течение нескольких дней.
5. Инъекция ДНК в эмбрионы
5.1. Подходящая для инъекции стадия эмбрионального развития
Эмбриональное развитие дрозофилы подразделяется на ряд морфологически различающихся стадий. Всестороннее описание этих стадий и превосходные микрофотографии можно найти в
[27]. Ранний эмбрион представляет собой синцитий с делящимися ядрами. Примерно через два часа после оплодотворения (при 25 °С) начинается формирование отдельных одноядерных клеток. Первыми оформляются полярные клетки на заднем конце эмбриона, которые в будущем дадут начало яйцеклеткам и сперматозоидам взрослых особей. Приблизительно через 1 ч после оплодотворения, незадолго до начала формирования полярных клеток, желток отделяется от вителлиновой мембраны на заднем конце эмбриона, оставляя прозрачную, наполненную жидкостью полость — так освобождается жизненное пространство для развивающихся полярных клеток. Эту стадию легко идентифицировать, и эмбрионы, достигшие именно этой стадии развития (или более ранние), — идеальный объект для микроинъекции (рис. 2).
5.2. Микроинъекция
Для успешной трансформации необходимо, чтобы Р-элемент попал в зародышевую ткань эмбриона. Это достигается за счет инъецирования плазмидной ДНК в заднюю часть эмбриона, завершающего стадию синцития, непосредственно перед началом формирования полярных клеток. Чтобы замедлить процесс развития эмбриона, инъекции проводят при 18°С в прохладной комнате или на охлаждаемом предметном столике микроскопа (впрочем, это условие не является абсолютно необходимым). , j
398
Глава 5
ь
Рис. 2. Микрофотография развивающегося эмбриона дрозофилы. А. Эмбрион на стадии, предшествующей бластулядии (приблизительно 1 ч после оплодотворения) в момент инъекции. Обратите внимание на свободное пространство у заднего конца — оно предназначено для развивающихся полярных клеток. Б. Эмбрион на стадии бластодермы. На этой стадии инъецировать ДНК уже поздно: полость у заднего конца эмбриона заполнена округлыми полярными
клетками.
Покровное стекло с эмбрионами прикрепите к предметному стеклу с помощью липкой ленты или просто каплей воды и поместите стекла на столик микроскопа так, чтобы задние концы эмбрионов были направлены в сторону иглы. Расположите эмбрионы так, чтобы их концы были в центре поля зрения. Теперь, используя микроманипулятор, вводите в поле зрения иглу; ее направление должно совпадать с продольной осью эмбриона, но держать ее надо чуть выше фокальной плоскости эмбриона. Сфокусируйте микроскоп на средней плоскости эмбриона (так, чтобы контур его задней части выглядел максимально четким). С помощью микроманипулятора медленно введите иглу в фокус микроскопа — при этом игла расположится в средней плоскости эмбриона. Это как раз и есть тот уровень, на котором следует производить укол. Окончательно скоррек-
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы____________399
тировать положение иглы можно путем легкого пробного «покалывания» эмбриона (с помощью манипулятора предметного столика); затем эмбрион осматривают и оценивают расположение вмятинок, оставляемых иглой на его поверхности.
Пользуясь микроманипулятором или манипулятором предметного столика, проколите иглой вителлиновую мембрану эмбриона. Тем, кто не склонен к тонким осторожным движениям и медленной кропотливой работе, возможно, покажется, что двигать иглу к эмбриону не такое нудное дело, как перемещать эмбрион по направлению к игле, однако манипулирование предметным столиком обеспечивает большую точность движений. Таким образом, яйцо как бы накалывается на иглу. Когда прокол произведен, иглу выводят несколько назад, так чтобы «е конец оказался непосредственно за границей желтка: ДНК лучше вводить не в наполненную жидкостью полость, где будут развиваться полярные клетки, а в ту область желтка, где на стадии синцития локализуются ядра будущих полярных клеток. Тонкая острая игла наносит эмбриону минимальные повреждения, потому что для прокалывания вителлиновой мембраны она требует меньшего усилия и, следовательно, проникает на меньшую глубину, чем более толстая или более тупая игла. К тому же она оставляет после себя относительно небольшое отверстие на поверхности эмбриона. Старайтесь не сильно тревожить желток: толстая игла или неосторожные движения могут нарушить систему позиционного контроля в яйце, которая обеспечивает правильное эмбриональное развитие.
