Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Поместите покровное стекло с эмбрионами в чашку Петри на слой осушителя —Drierite (СаСЬ) или силикагеля — и закройте чашку. В принципе оптимальным следует считать минимальное высушивание, необходимое для того, чтобы полностью сохранить содержимое яйца при инъекции в него раствора ДНК- Время оптимального высушивания зависит от влажности воздуха в комнате, количества связанной воды в составе осушителя, продолжительности процедуры раскладывания эмбрионов на липкой ленте и т. д. Обычно сушка занимает от 5 до 15 мин. После высушивания немедленно покройте эмбрионы каплей масла Halocarbon — она будет их единственной защитой от внешней среды до того момента, когда выведутся личинки. Масло выпускается различной вязкости. Маловязкое масло стечет и не сможет предохранить яйца от высыхания. Слишком вязкое масло затрудняет оперирование иглой. Оптимальной можно считать вязкость масла серии 700 (Halocarbon products).
Трансформация клеток зародышевого пути дрозофилы
395
Масло Voltalef Grade 10S чуть менее вязкое, но вполне пригодное, предпочтительнее было бы Grade 20S, но его трудно приобрести.
4.5. Изготовление и подготовка иглы
Игла должна быть как можно более тонкой, чтобы повреждение эмбриона было минимальным, но в то же время ее просвет должен быть достаточным, чтобы можно было без труда вводить внутрь эмбриона раствор ДНК.
Микрокапилляр вытягивают на специальном электрическом приборе в тонкую иглу (<1 микрона), которая у основания имеет вид тупого конуса, а дальше по направлению к острию приобретает остроконечную форму; ее длина от начала конусной части до острия составляет примерно 0,5 см. Слишком тонкая в дистальной части игла будет изгибаться в вязком масле при малейшем перемещении столика микроскопа, и придется ждать, когда она прекратит колебаться, чтобы продолжить работу. Если же игла в дистальной части будет иметь слишком выраженную коническую форму, она проделает в эмбрионе очень большое отверстие. Из микрокапилляров фирмы Drummond получаются неплохие иглы для микроинъекций, однако для изготовления «идеальных» игл нужны микрокапилляры с тонким стеклянным рубчиком (филаментом) на внутренней поверхности: такая конструкция сильно облегчает процедуру заполнения иглы, так как капля раствора ДНК, помещенная в верхней, широкой части иглы, сама перемещается в ее нижнюю часть за счет капиллярных сил, возникающих на поверхности рубчика.
Силиконировать микрокапилляры не обязательно, необходимо лишь, чтобы они были чистыми изнутри, так как даже мельчайшая пылинка может закупорить просвет иглы. Поэтому следует промыть микрокапилляры фильтрованным абсолютным этанолом.
Закрепите иглу в микроманипуляторе и осмотрите ее конусную часть и запаянный кончик под микроскопом. Удалить запаянный конец (заострить иглу) можно путем легкого постукивания или притирания ее кончика о край покровного стекла, прикрепленного к предметному стеклу. Сперва сфокусируйте микроскоп на стекле, а затем с помощью микроманипулятора медленно введите в поле зрения иглу. С помощью манипулятора предметного столика попробуйте несколько раз провести краем стекла по кончику иглы. В идеале отверстие иглы должно иметь в диаметре приблизительно 1 мкм и быть слегка скошенным. Конечно, описанная процедура в известной степени рассчитана на удачу, однако практика показывает, что получить желаемый результат все-таки можно. Выньте иглу из ап-
396
Глава 5
парата — она готова для заполнения. Можно сделать и по-другому: сначала заполнить иглу раствором ДНК, а уже затем заниматься удалением запаянного конца.
4.6. Приготовление ДНК для инъекции
Суперспирализованные плазмиды, несущие в своем составе транспозоны и хелперные P-элементы, должны присутствовать в растворах, свободных от потенциально вредных химических агентов, таких, как CsCl, трис и ЭДТА. Предназначенную для инъекции ДНК осадите спиртом, осадок соберите центрифугированием и осторожно промойте сначала 70%-ным этанолом в присутствии 0,2 М NaCl и затем водным 70%-ным этанолом. Растворите осадок ДНК в буфере для инъекции (5 мМ КС1;
0,1 мМ фосфат натрия pH 6,8) до конечной концентрации 1 мг/мл. Чистые препараты ДНК весьма стабильны в этом буфере и без заметного вреда переносят даже повторные циклы замораживания — оттаивания.
Смешайте растворы плазмид, содержащих транспозоны и хелперные элементы в необходимой пропорции, и доведите суммарную концентрацию ДНК в растворе до требуемой величины. Как уже упоминалось ранее, оптимальное соотношение плазмид точно неизвестно. Изначально было предложено соотношение 5:1, чтобы уменьшить вероятность транспозиции хелперного элемента. Очевидно, однако, что в случае использования хелперной плазмиды pn25.7wc это соображение можно не принимать в расчет. Концентрация хелперной ДНК не должна превышать 500 мкг/мл, так как более высокая концентрация не увеличивает эффективность трансформации и даже может оказывать противоположное действие [2], вероятно, за счет локального создания в эмбрионе клеточной среды Р-цитотипа (блокирующего транспозицию P-элементов). В то же время нет видимых причин ограничивать количество рекомбинантной ДНК на основе Р-вектора. Смесь, содержавшая по 250 мкг/мл вектора и хелперной плазмиды pn25.7wc, позволила добиться 30%-ной трансформации [5]. Соотношение в смеси векторной плазмиды и хелперной плазмиды 10: 1 (суммарная концентрация ДНК 5 мкг/мл) также дало хорошие результаты — в одном эксперименте эффективность трансформации достигла 50%
