Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
424
Глава 6
6.1. Растворы для DEAE-декстранового метода
1. ДЕАЕ-декстрановый концентрированный раствор. Содержит 100 мг/мл ДЕАЕ-декстрана в буфере TBS. Раствор стерилизуют фильтрованием и хранят в аликвотах при —20°С.
2. Буфер TBS: 25 мМ трис-НС1 pH 7,4; 137 мМ NaCl; 5 мМ КС1; 0,7 мМ СаС12; 0,5 мМ MgCl2; 0,6 мМ Na2HP04.
6.2. Методика трансфекции для монослойной культуры клеток
на 10-см чашке
1. Промойте клетки средой DMEM. Среда не должна содержать сыворотки; промывать следует четыре раза, после чего отмойте клетки один раз буфером TBS. Присутствие сыворотки на этой стадии может ингибировать трансфекцию.
2. Приготовьте раствор, содержащий 20 мкг ДНК в 250 мкл TBS и 80 мкл ДЕАЕ-декстранового концентрированного раствора.
3. Смешайте этот раствор с 4 мл среды DMEM (без сыворотки) и пипеткой нанесите на отмытые клетки.
4. Инкубируйте клетки при 37 °С в течение 3 ч. Это оптимальная продолжительность инкубации для большинства моно-слойных клеточных культур.
5. Промойте клетки дважды TBS и добавьте свежую среду.
6.3. Варианты основной процедуры
6.3.1. Трансфекция лимфоцитов
1. Из запасного концентрированного раствора ДЕАЕ-декстрана (100 мг/мл) приготовьте раствор ДЕАЕ-декстрана в TBS (1 мг/мл) и храните его при 4°С.
2. Следуйте п. 1 методики, описанной в разд. 6.2. Затем смешайте 250 мкл буфера TBS, содержащего 5 мг ДНК и 250 мкл раствора ДЕАЕ-декстрана (2 мг/мл).
3. Суспендируйте 107 клеток в 0,5 мл полученного на стадии 2 раствора. Инкубируйте клеточную суспензию при комнатной температуре в течение 30 мин.
4. Добавьте 4,5 мл TBS и осадите клетки центрифугированием.
5. Промойте клетки дважды нормальной средой и высевайте в многолуночные планшеты.
Продолжительность временной экспрессии может варьировать в зависимости от индивидуальных особенностей ДНК. Для ДЕАЕ-декстрановой трансфекции оптимальное время составляет 24—48 ч.
Высокоэффективный перенос генов в клетки млекопитающих 425
6.3.2. Обработка хлорохином
Хлорохин повышает эффективность экспрессии плазмидной ДНК, если обработать им клетки после трансфекции (как каль-ций-фосфатной, так и ДЕАЕ-декстрановой) [13]. Количество хлорохина, вероятно, придется подбирать для конкретного типа клеток, однако можно воспользоваться следующими обобщенными рекомендациями. Хлорохин (Sigma) может храниться в темноте в виде раствора (2 мг/мл) при 4°С в течение недели. Обычно используют 100-кратное разведение такого раствора, чтобы получить конечную концентрацию 200 мкг/мл в среде DMEM. Хорошие результаты были достигнуты при добавлении хлорохина непосредственно в раствор ДНК — при этом обеспечивается относительно непродолжительный контакт клеток с хлорохином. Токсический эффект хлорохина начинает сказываться через 4 ч инкубации.
6.3.3. Глицериновый шок после ДЕАЕ-декстрановой трансфекции
Не так давно было показано, что глицериновый шок после ДЕАЕ-декстрановой трансфекции ощутимо повышает уровень временной экспрессии [16]. Методика идентична процедуре, описанной в разд. 5.2, с той только разницей, что клетки собирают через 72 ч после трансфекции. Рекомендуется также увеличить количество используемой плазмидной тест-ДНК (от 15 до 25 мкг на 60 мм чашку).
7. Временная экспрессия
Мы уже упоминали, что на практике нередко возникает проблема выбора экспериментальной процедуры, для решения которой необходимо как-то оценить эффективность трансфекции различных типов клеток. Идеальный методический прием для подобной оценки — временная экспрессия; этот способ относительно прост и позволяет быстро определить целый ряд интересующих параметров. Тестируя экспрессию маркерного фермента, который кодируется плазмидной ДНК, можно сравнить различные методики трансфекции и выбрать наилучшую (применительно к конкретным условиям). Для реализации этого подхода оказалась полезной методология, давно отработанная на прокариотических системах. Контролирующие последовательности состыковывают с кодирующим участком гена какого-нибудь удобного с точки зрения идентификации маркерного белка; теперь функционально активный ген можно обнаружить энзиматическими методами. Этот подход в ряде случаев оказывается более чувствительным и точным в количественном отношении, чем измерение собственно транскрипционной активности гена.
426
Глава 6
Еще одно преимущество данного метода заключается в том, что он позволяет относительно легко анализировать влияние тех или иных изменений, вносимых в основную экспериментальную процедуру. Наибольшее распространение получили системы временной экспрессии на основе бактериальных генов. Основное их преимущество в том, что бактериальный продукт легко обнаружить на фоне эукариотических изозимов. В случае же систем с CAT такой проблемы вообще нет, поскольку отсутствует соответствующий животный белок. Две наиболее распространенные системы временной экспрессии описаны ниже. Известны также системы на основе генов галактокиназы Е. coli [17], gpt [18] и neoR [19], однако они менее употребимы ввиду сложности определения соответствующих продуктов. Тестировать временную экспрессию можно не только с помощью энзиматических методов, но и иммунологически — с использованием меченых антител. Так, иммунодетекция позволяет легко выявлять и идентифицировать такие маркеры, как CAT и [J-галактозидаза. Помимо бактериальных маркеров для оценки эффективности трансфекции широко используют системы, экспрессирующие вирусные антигены.
