Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
6. При необходимости можно отделить интактные протопласты от разрушенных, используя центрифугирование в среде CPW 21S, соответствующая процедура описана в табл. 14.
7. Промойте осадок протопластов, ресуспендируя его в M'SPl 9 М. Подсчитайте их число и затем высейте, как описано в табл. 14.
8. Проведите селекцию трансформантов, высевая микроколонии на соответствующую селективную среду, как описано в табл. 19.
Однако в отдельных случаях все-таки формируются трансформированные побеги, которые очень редко дают корни. Это наблюдается для корончатых галлов (в особенности для тех опухолей, которые были индуцированы shooty-иутаптаип агробактерий) и для тканей, трансформированных путем совместного культивирования с опс+-штаммами. В тех случаях, когда удалось получить интактные трансформированные растения [29], было показано, что трансформационные маркеры стабильно проходят через мейоз, только если Т-ДНК претерпела делеции и перестройки, нарушившие функционирование онкогенных локу-сов (tmsl, tms2, tmr). Естественно, максимум усилий был сразу же направлен на то, чтобы получить опс~-векторы (см. разд. 2), которые, сохраняя функции гена vir, сохраняли бы также способность к трансформации растительной ткани, не вызывая ее опухолевого перерождения. Селекцию трансформантов предполагалось осуществлять, используя доминантный селективный маркер (например, Ктг), введенный между концами Т-ДНК [30].
3.5.1. Регенерация на среде, индуцирующей побеги у трансформантов, полученных с помощью неонкогенных штаммов
Трансформацию проводили, как описано в разд. 3.2; популяцию трансформированных клеток обогащали, используя соответствующие селективные среды. Затем каллус, развившийся из этих трансформированных тканей, переносили на среду, ко-
23*
356
Глава 4
торая в норме индуцировала регенерацию каллуса растения того же вида. Так, например, у N. tabacum можно вызвать регенерацию побегов, если культивировать каллус на агаризован-ной среде MSO, содержащей 1—2 мг/л 6-бензиламинопурина и 3% сахарозы при 25 °С и интенсивности освещения 1000 люкс. В целом же высокое содержание в среде цитокинина относительно ауксина индуцирует регенерацию у многих видов. Если ткани загрязнены живыми агробактериями, в среду следует включить антибиотик. Регенерированные побеги отделяют от каллуса и переносят на среду MSO для того, чтобы на них могли сформироваться корни. Когда высота побегов достигнет 3—5 см, их можно перенести на компост и выращивать в теплице, следя за тем, чтобы в течение 1—2 недель проростки не страдали от недостаточной влажности воздуха. Для этого можно лоток с проростками накрыть чистым пластиковым мешком на несколько дней после того, как они были отделены от каллуса. Затем мешок разрезают вдоль по одной из сторон, чтобы уменьшить влажность, и когда растения окрепнут, снимают совсем. Можно также выращивать проростки до этой стадии во влажном инкубаторе.
3.5.2. Регенерация трансформированных побегов с помощью коинфекции shooty-мутантами и опс~-штаммами A. tumefaciens
Ti-плазмидные мутанты по генам tmsl или tms2 вызывают опухоли с характерным фенотипом (рис. 10). Экспрессия этих двух локусов в норме подавляет образование побегов в корончатых галлах, поскольку вызывает гиперпродукцию ауксинов в опухоли. Экспрессия гена tmr подавляет формирование корней из-за гиперпродукции цитокининов. В отсутствие экспрессии генов tmsl или tms2 или при пониженном" ее уровне гиперпродукция цитокинина, обусловленная нормальной активностью гена tmr, стимулирует спонтанную регенерацию побегов в таких опухолях. Побеги, развивающиеся из опухолей, которые индуцированы shooty-мутантами октопинового типа, редко оказываются трансформированными. Следовательно, можно предположить, что трансформированные клетки в таких опухолях стимулируют регенерацию в окружающих нетрансформированных клетках. Это свойство часто используют для того, чтобы заставить регенерировать клетки, трансформированные опс~-векторами, путем коинфекции раневых участков shooty-мутантами (например, pGV2215) и ояс~-штаммами Agrobacterium [16]. Трансформацию осуществляют так же, как это описано для ояс+-векторов в разд. 3.2, используя смесь клеток onc~jtms в отношении 5/1. Регенерированные побеги отделяют от трансформированной ткани и анализируют на экспрессию трансформационных маркеров, как описано в разд. 5.
Рис. 10. Корончатый галл на растении N. tabacum, развившийся в результате инфекции мутантной по гену (ms Ti-плазмидой октопинового типа. Отметим, что первичным ответом на инфекцию является пролиферация каллуса, а затем происходит развитие побегов. Если вводить мутантные по trns Ti-плазмиды в стерильные проростки, развиваются более многочисленные побеги, ims-Мутанты можно использовать в экспериментах по коинфекции с ояс~-векторами.
358
Глава 4
Если в качестве маркера используют устойчивость к кана-мицину, трансформированные побеги можно отличить от не-трансформированных, перенося их (когда в длину они достигнут около 1 см) на среду MSO, содержащую соответствующее количество канамицина (обычно 100 мкг/мл); в этих условиях развиваются только трансформированные побеги.
