Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
'антибиотиков. Перенесите 50 колоний размером' 2—5 мм в чашку Петри диаметром 9 см с 25 мл среды (см. рис. 9).
') Рецептура сред приведена в табл. 9.
Таблица 19. Селекция о/гс~-трансформантов, экспрессирующих устойчивость к канамицину
1. Перенесите колонии (см. п. 6 табл. 17) в центрифужные пробирки н промойте 12 мл среды Caboche, содержащей 100 мкг/мл канамицина, а также
0,5 мг/мл карбенициллина (или другого подходящего антибиотика) для того, чтобы ингибировать рост агробактерий.
2. Подсчитайте число колоний в 1 мл и внесите суспензию при плотности 500 колоний на 1 мл в 8 мл агаризованной среды Caboche, содержащей соответствующий антибиотик и 100 мкг/мл канамицина; наслоите агар на чашку Петри диаметром 9 см, залитую 100 мл этой же среды.
3. Отберите канамицинустойчивые колонии и перенесите их на среду MSP1, последовательно снижая содержание антибиотиков, убивающих агробактерии и поддерживая оптимальный уровень канамицина (200— 1000 мкг/мл) для селекции устойчивых к канамицину колоний трансформированных растительных клеток.
') См. табл. 9.
ции в среде 100 мкг/мл (разд. 2). Рост нормальных клеток заметно угнетается при концентрациях канамицина в среде, превышающих 50 мкг/мл.
3.4. Введение ДНК в растительные клетки с помощью изолированных ДНК-векторов
Трансформация интактных растений или растительных клеток путем их взаимодействия с опс+- или опс~-бактерия ми A. tumefaciens весьма эффективна, но не лишена ряда недостатков. Одна из главных проблем заключается в том, что однодольные растения не удается трансформировать с помощью Agrobacterium. Многие хозяйственные культуры, в первую очередь бобовые, демонстрируют слабую реакцию на заражение Agrobacte-
23-196
354
Глава 4
rium, а протопласты этих видов часто оказываются недостаточно выносливыми, чтобы выдержать процедуру культивирования. Кроме того, экстракты трансформированных тканей, используемые для изучения транскрипции и трансляции трансформированных генов, могут быть загрязнены агробактериями, что ведет к различного рода ошибкам. И наконец, существующие методики генно-инженерных экспериментов с Ti-плазмидами достаточно сложны и трудоемки и требуют больших затрат времени. Перечисленные неудобства стимулировали поиск и разработку систем переноса ДНК в клетки высших растений, которые бы не были связаны с использованием вирулентного A, tumefaciens.
Было разработано несколько методов введения биологически активных нуклеиновых кислот в эукариотические клетки; многие из них были опробованы на растительных протопластах с весьма скромным успехом. Перечислим основные методические разработки в этой области.
1. Химически стимулируемый захват изолированной ДНК или ДНК-преципитата с использованием таких активаторов процессов эндоцитоза и слияния клеток, как полиэтиленгликоль (PEG).
2. Слияние или эндоцитоз содержащих плазмиды липосом с растительными протопластами.
3. Слияние или эндоцитоз содержащих плазмиды бактериальных сферопластов с растительными протопластами.
4. Прямое введение плазмидных векторов в растительные протопласты и их ядра путем микроинъекций.
Все эти методики нашли свое отражение в обзоре [26J. На сегодняшний день наиболее удачной из них следует признать процедуру введения Ti-плазмидной ДНК в растительные протопласты с применением PEG [27, 28], хотя выход трансформированных клеток здесь чрезвычайно низок (~10^5). Не вызывает, однако, сомнения, что все описанные методики действительно обеспечивают введение ДНК в интактной форме по крайней мере в цитоплазму протопластов и что отсутствие трансформации связано с конструкцией вектора или компетентностью протопластов. Методика стимулируемого полиэтиленгликолем введения плазмидной ДНК в протопласты описана в табл. 20. Эта же процедура может использоваться для слияния протопластов с липосомами или сферопластами Е. coli. В случае использования сферопластов целесообразно попробовать увеличить концентрацию PEG до 25% (по весу).
3.5. Регенерация трансформированных растений
Исследования, проведенные в последние несколько лет, показали, что регенерировать растение из тканей, трансформированных онкогенными штаммами A. tumefaciens, невозможно.
Генетическая инженерия растений
355
Таблица 20. Трансформация растительных протопластов изолированными плазмидными векторами с использованием полиэтиленгликоля
1. Приготовьте протопласты, как описано в табл. 14. Осадите 1—3 106 протопластов в среде MSP1 9М в центрифужной пробирке размером 16X125 мм.
2. Добавьте плазмидную ДНК (в стерильной дистиллированной воде) в минимально возможном объеме (например, 25 мкг в 20 мкл) и аккуратно перемешивайте в течение 10 с пастеровской пипеткой.
3. Добавьте 2 мл стерильного 15%-ного (по весу) раствора PEG 6000 (K.och-Light Ltd.) в среде MSP1 ЭМ и перемешайте, покатав пробирку между ладонями.
4. Инкубируйте при 27 °С в течение 30 мин и затем медленно добавьте 10 мл MSP1 9 М.
5. Осадите протопласты центрифугированием при 100 g в течение 10 мин и затем ресуспендируйте их в 1 мл MSP1 9 М.. Оставьте ка 30 мин при комнатной температуре.
