Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
12. Проведите выделение ДНК, руководствуясь методикой выделения ядерной ДНК, описанной в табл. 25 (стадия 9 и 10).
’) Буфер для выделения органелл F: 300 мМ маннитол; 50 мМ трис-НС1 pH 8,0; 3 мМ. ЭДТА; 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА); 1 мМ 2МЭ. Раствор готовят и автоклавируют без БСА и 2МЭ; эти компоненты добавляют в стерильный буфер непосредственно перед использованием.
г) ДНКазный буфер G идентичен буферу F, ио содержит дополнительно 13 мМ MgCl2 и 150—500 мкг/мл ДНКазы, добавляемой непосредственно перед использованием. а) Буфер для промывки органелл Н: 150 мМ NaCl; 100 мМ ЭДТА pH 8,0.
4) См. примечание 5 к табл. 25.
Выделение ядерной ДНК из листьев или каллуса описано-в табл. 25. Возможно, для того, чтобы приспособить эту методику к конкретному растительному материалу, придется изме-
нить длительность или мощностной режим гомогенизации (см. стадию 4). Аналогично может понадобиться изменение стадии 6, чтобы избежать заметного загрязнения препарата ядер хлоро-пластами. В ходе работы целесообразно проверять чистоту препарата ядер под микроскопом, окрашивая небольшие аликвоты акридиновым оранжевым (табл. 165).
Генетическая инженерия растений
367
«Высококачественные» транскрипционно активные ядра обычно удается выделить из растительных протопластов путем мягкого лизиса последних в гипертонических буферах [32]. Однако этот метод применим лишь в тех случаях, когда можно получить достаточное количество протопластов.
1. Выделяют протопласты, как это описано в табл. 14.
2. Ресуспендируют протопласты в буфере для выделения ядер [100 мМ глицин; 1% гексиленгликоль; 2% сахароза; pH довести до 8,5 насыщенным раствором Са(ОН)2] при 4°С из расчета 1 мл буфера на миллион протопластов. Переносят суспензию в силиконированную пробирку Согех (30 мл).
3. Добавляют тритон Х-100 до концентрации 0,1% и инкубируют во льду в течение 10 мин, мягко пипетируя суспензию с помощью пластиковой одноразовой пастеровской пипетки для полного лизиса протопластов.
4. Проверяют под микроскопом, все ли протопласты вскрылись, после чего осаждают ядра центрифугированием при 200g в течение 10 мин при 4°С.
5. Далее выделяют ядерную ДНК, как это описано в табл. 25, начиная со стадии 5 и соответствующим образом уменьшив объемы используемых растворов.
Выделение ДНК из хлоропластов и митохондрий описано в табл. 26. Экспериментальные процедуры, используемые для получения ДНК из этих органелл, аналогичны тем, которые применяются при получении ядерной ДНК, и обычно включают разрушение растительных клеток, осаждение более тяжелой ядерной фракции, среднескоростное центрифугирование хлоропластов и затем высокоскоростное центрифугирование того же экстракта для получения митохондрий [33].. После промывки и ДНКазной обработки препаратов органелл приступают к выделению ДНК, используя в основном те же приемы, что и при выделении ДНК из клеточных ядер.
4.3. Выделение растительной РНК
Главная проблема при выделении РНК — обеспечить количественный выход чистой нуклеиновой кислоты при минимальной степени ее деградации. Принципиальными моментами здесь являются по возможности полное ингибирование рибонуклеаз-ной активности и эффективное разрушение РНК-белковых комплексов (рибонуклеопротеинов, РНП). Опубликовано много методов выделения РНК из различных растительных источников; эти методы основаны на использовании либо фенола, являющегося мощным денатурирующим белки агентом, либо высококонцентрированных солевых растворов (например, 4М гуанидин-хлорид), в которых РНК остается в растворимой форме, а бел-
368
Глава 4
ки денатурируют и выпадают в осадок, либо растворов протеаз, гидролизующих белковые компоненты РНП [34].
Пожалуй, наибольшее распространение имеют методики, предусматривающие использование фенола, поэтому в данном разделе мы приводим обобщенный метод фенольной экстракции РНК, который можно применять для работы с самыми разными источниками растительного материала. Ингибирование рибонук-леаз — крайне важная проблема в любой процедуре выделения РНК. Ниже подчеркнуты узловые моменты, на которые следует обратить особое внимание в плане предотвращения деградации РНК внеклеточными ферментами.
1. Стеклянную посуду необходимо простерилизовать либо в сушильном шкафу (150°С 3 часа), либо автоклавированием, либо погрузив в 0,5%-ный диэтилпирокарбонат и затем выдержав 5 мин при 100°С.
2. Все растворы, используемые в работе, следует по возможности автоклавировать.
3. Рабочее место должно быть чистым. Работать следует в резиновых перчатках разового пользования, чтобы предотвратить загрязнение рибонуклеазами, всегда присутствующими на коже рук.
4. РНК должна храниться в присутствии детергента или в этаноле при низких температурах (от —20 до —80 °С).
5. Для работы следует использовать только особо чистые реактивы (например, выпускается сахароза, свободная от РНКаз).
Процедура выделения суммарной растительной РНК описана в табл. 27. Эта методика рассчитана на работу со свежим листовым материалом, полученным от широколиственных растений [36J. При использовании же других источников растительного материала — культур тканей, плодов и т. д.— следует соответствующим образом изменить количественные параметры процедуры (такие, как объемы растворов, навески ткани и т. п.), чтобы обеспечить эффективную экстракцию РНК и удобство работы.
