Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 161

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 155 156 157 158 159 160 < 161 > 162 163 164 165 166 167 .. 253 >> Следующая

2. Поместите порошок в полипропиленовый центрифужный стакан на 50 мл (например, Nalgene type 3100—0500 или эквивалентный). Добавьте
.15 мл буфера для экстракции (ЕВ)‘> и мягко перемешайте пластиковой палочкой до гомогенного состояния.
3. Закройте стакан и инкубируйте на водяной бане при 56 °С в течение ‘20 мин и время от времени мягко перемешивайте содержимое, покачивая
стакан.
4. Охладите смесь до комнатной температуры. Следите за тем, чтобы температура не опускалась ниже 15 °С, так как СТАВ может выпасть в осадок.
5. Добавьте 15 мл смеси хлороформ: октанол (24 : 1, по объему); за-• кройте стакан и аккуратно перемешайте, переворачивая стакан до образова-. ния однородной эмульсии2).
6. Осадите клеточные обломки и разделите водную и органическую, фазы центрифугированием при 8000 g (например, при 10 000 об/мин в роторе
. Sorval SS34, 8x50 мл) в течение 10 мин при 20 °С.
7. Отберите водную фазу (верхнюю) в чистый центрифужный стакан на 50 мл. Следите за тем, чтобы не захватить денатурированных белков, собранных в интерфазе.
8. Добавьте 1/10 объема (примерно 1,5 мл) 10%-ного (по весу) раствора СТАВ в 0,7 М NaCl. Мягко перемешайте и повторите экстракцию смесью хлороформ : октанол.
9. Стараясь не захватить частиц интерфазы, отберите водную фазу в ' подходящую стеклянную центрифужную пробирку (например, Согех) или
высококачественные пробирки для низкоскоростного центрифугирования (Corning 16X125 мм Ругех).
10. Добавьте равный объем буфера для осаждения3*, мягко перемешайте и оставьте при комнатной температуре на 30 мин, чтобы осадок сформировался.
11. Открутите осадок при 1500 g в течение 10—15 мин при комнатной температуре. Не следует центрифугировать при больших значениях g или более продолжительное время, так как чрезмерно плотный осадок очень трудно растворить. Хорошим считается препарат, если осадок имеет белый цвет или слегка окрашен.
12. Осушите осадок, перевернув пробирку и поставив ее вертикально на лист фильтровальной бумаги. На этой стадии, если это необходимо, препарат можно оставить на ночь при 4 °С или сразу приступать к очистке ДНК. Соответствующая методика изложена в табл. 22.
¦) Буфер для экстракции (ЕВ): 50 мМ трис-НС1 pH 8,0; 0,7 М; NaCl 10 мМ ЭДТА; 1% (по весу) СТАВ (Sigma Н-5882); 1% (по объему) 2-меркаптоэтанола (2МЕ). Компоненты буфера, за исключением 2МЕ, соединяют на мешалке с нагревом, следя за тем, чтобы раствор не вспенивался, и автоклавируют; 2МЕ добавляют после того, как буфер охладится до комнатной температуры.
2) Работайте под тягой и время от времени приоткрывайте крышку, чтобы сбросить избыточное давленяе.
3) Буфер для осаждения: 50 мМ трис-НС1 pH 8,0; 10 мМ ЗДТА; 1% (по весу) СТАВ.
Генетическая инженерия растений
361;
Таблица 22. Очистка растительной ДНК в градиенте плотности CsCl
1. Растворите осадок (см. п. 12 табл. 21) в 2,4 мл 1 М CsCl/EtBr‘> на водяной бане при 56 °С. Этидиумбромид поможет проконтролировать, не осталось ли заметных количеств нуклеиновой кислоты на стенках центрифужного стакана. Обратите внимание, что, несмотря на присутствие 1 М CsCl/EtBr, непрозрачный осадок СТАВ растворяется легко и быстро — нуклеиновые кислоты растворяются медленнее.
2. Перенесите раствор в ультрацентрифужную пробирку для ротора Beckman VTi65 (или эквивалентного). Добавьте 2,9 мл 7 М CsCl/EtBr2), закройте пробирку и перемешайте содержимое, осторожно переворачивая ее.
3. Центрифугируйте при 58 ООО об/мин в течение 4 ч или при 40 000 об/мин в течение ночи (16 ч).
4. Визуализируйте полосу ДНК, используя источник длинноволнового УФ-излучения (320 нм) и отберите материал при помощи шприца на 1 мл, проколов пробирку сбоку. РНК осаждается на стенке пробирки; старайтесь не потревожить этот осадок.
5. Удалите этидиумбромид путем пятикратной экстракции изопропанолом (пропанол-2), насыщенным NaCl. Этидиумбромид уйдет в органическую фазу.
6. Удалите CsCl путем диализа против 2 л дистиллированной воды при 4°С. Диализуйте в течение 24 ч на магнитной мешалке, меняя воду не менее 3 раз.
7. Измерьте концентрацию ДНК в растворе на спектрофотометре при длине волны 250 нм в кварцевой кювете (1 единица ОП = 5б мкг/мл).
8. Добавьте 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и осадите ДНК двумя объемами охлажденного этанола при •—20 °С в течение ночи.
9. Центрифугируйте в течение 3 мин на микроцентрифуге или 15 мин при 8000 g в силиконированной пробирке Согех на центрифуге Sorvall (или эквивалентной). Высушите осадок ДНК в вакууме и растворите в стерильной дистиллированной воде до желаемой концентрации. Раствор можно хранить при — 20 °С; ДНК стабильна в течение нескольких лет. Можно также хранить ДНК в виде промытого осадка в 80%-ном этаноле.
') 1 М CsCl/EtBr: 1 М CsCl; 50 мМ трис-НС1 pH 8,0; 10 мМ ЭДТА; 0,2 мг/мл этнди-умбромида.
’) 7 М CsCl/EtBr: 7 М CsCl; 0,1% саркозил (Ciba Geigy NL 35); 0,2 мг/мл этидиум-бромида.
Предыдущая << 1 .. 155 156 157 158 159 160 < 161 > 162 163 164 165 166 167 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed