Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
вокислотный комплекс преципитирует, тогда как большая часть полисахаридов останется в растворе [31]. ДНК затем отделяют от РНК и СТАВ путем обычного ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl с этидиумбромидом (EtBr). Для этого преципитат растворяют в высокосолевом растворе (~1М) и наносят препарат на градиент CsCl с этидиумбромидом. Методика, описанная в табл. 22, предполагает использование пробирок для ротора Beckman VTi65 объемом 5,2 мл, однако все объемы можно пропорционально изменить применительно к любому имеющемуся в распоряжении высокоскоростному вертикальному или угловому ротору, так чтобы конечная плотность осталась прежней (1,55 г/мл).
Для препаративного выделения ДНК можно использовать и свежий растительный материал:
1. Промойте растительный материал в 70%-ном этаноле и
362
Глава 4
затем ополосните дистиллированной водой. Быстро заморозьте 10 г ткани в жидком азоте.
2. Поместите замороженную ткань в предварительно охлажденную ступку и разбейте пестиком крупные куски. Насыпьте в ступку 4 г окиси алюминия и быстро разотрите в тонкий порошок, пока ткань не оттаяла.
3. Перенесите гомогенат в центрифужный стакан на 50 мл, добавьте 0,2 мл 2-меркаптоэтанола и затем 10 мл (или больше, если это необходимо) двукратного буфера для экстракции (см. примечание к табл. 21), предварительно нагретого до 95°С. Немедленно перемешайте пластиковой палочкой.
4. Инкубируйте закрытый стакан на водяной бане при 56 °С в течение 20 мин.
Далее следуйте методике, описанной в табл. 21, начиная с п. 4.
4.1.2. Ускоренный метод выделения ДНК для блот-гибридизационного анализа трансформированных растительных тканей
Процедуру выделения ДНК с использованием СТАВ можно модифицировать применительно к конкретным задачам, например если возникла необходимость работать сразу со многими образцами тканей. Препараты ДНК, полученные по методике, изложенной в табл. 23, пригодны для блот-гибридизационного анализа (см. разд. 5) без дополнительной очистки в градиенте плотности CsCl, что дает значительную экономию растительного материала, времени и позволяет обойтись без дорогостоящего оборудования для ультрацентрифугирования.
4.1.3. Определение концентрации ДНК в препаратах нуклеиновых кислот с использованием дифениламина
Дифениламиновый реагент можно использовать для количественного анализа ДНК в грубых экстрактах растительных тканей благодаря его специфичности к тимидиновым остаткам (табл. 24). Высокая специфичность реакции в отношении ти-мидина позволяет легко обойти присутствие в препарате РНК-Кроме того, этот метод обеспечивает более высокую точность, чем определение оптической плотности раствора нуклеиновой кислоты при 260 нм. Разница в содержании нуклеиновой кислоты, определенном путем измерения ОП26о и на основании дифениламинового теста, позволяет судить о количестве РНК в препарате.
4.2. Выделение ДНК из клеточных ядер, митохондрий и хлоропластов
Описанные методы выделения ДНК из клеточных ядер, митохондрий и хлоропластов позволяют работать с каллусом, листовым материалом, протопластами и отдельными клетками.
Таблица 23. Получение небольших количеств растительной ДНК для блот-гибридизационного анализа по Саузерну
1. Отберите 0,1 г лиофилизированного каллуса или 0,07 г лиофилизиро-ванного листового материала (предварительно удалив центральные жилки). Разотрите ткань с 0,3 г окиси алюминия в небольшой ступке (диаметром
9 см). Если имеется достаточное количество материала, можно растереть больше ткани и затем уже отобрать необходимые количества для выделения
ДНК.
2. Перенесите тонкоизмельченную растительную ткань в пробирку для микроцентрифуги. Добавьте 600 мкл буфера для экстракции (ЕВ)1* и мягко перемешайте пластиковой палочкой. Инкубируйте 10 мин при 56 °С.
3. Добавьте 600 мкл смеси хлороформ: октанол (24:1), энергично встряхните и центрифугируйте 2 мин в микроцентрифуге, после чего перенесите водную фазу (верхний слой) в чистую пробирку для микроцентрифуги.
4. Промойте интерфазу (она образована денатурированными белками) 100 мкл буфера ЕВ, центрифугируйте, отберите водную фазу и объедините ее с основной водной фазой (см. п. 3).
5. Добавьте 1/10 объема 10%-ного раствора СТАВ (примерно 70 мкл) к объединенной водной фазе, перемешайте и повторите экстракцию смесью хлороформ : октанол.
6. Избегая загрязнения частицами интерфазы, отберите водную фазу и перенесите в чистую силиконированную центрифужную пробирку Ругех (например, 16-125 мм Corning). Добавьте равный объем буфера для осаждения1* (600 мкл), перемешайте и оставьте на 20 мин при комнатной температуре.
7. Центрифугируйте в настольной центрифуге при 2000 g в течение 15 мин. Удалите надосадочную жидкость и осадок подсушите на воздухе. Если осадок не удается собрать при указанном режиме, центрифугируйте в силикопированной пробирке Согех при 8000 g в течение 15 мин при 20 °С.
8. Растворите осадок (СТАВ-нуклеиновокислотный комплекс) в 400 мкл 1М NaCl. (При необходимости можно повысить температуру до 56 °С.) Перенесите раствор в стерильную пробирку для микроцентрифуги.
