Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 155

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 149 150 151 152 153 154 < 155 > 156 157 158 159 160 161 .. 253 >> Следующая

3.3.1. Получение протопластов из клеток высших растений
Методы получения протопластов различаются для разных видов растений и, кроме того, зависят от типа исходного растительного материала (например, мезофилл листа или суспензия культивируемых клеток). Процедуры приготовления и культивирования протопластов для многих растений можно найти в литературе [25, 26]. Следует лишь заметить, что для совместного культивирования с Agrobacterium пригодны только весьма жизнеспособные протопласты. В качестве модели мы выбрали клетки листового мезофилла N. tabacum var Xanthi и в данной главе рассмотрим процедуры приготовления, культивирования и трансформации протопластов на примере этого объекта. Фо-
Рис. 7. Последовательные этапы синтеза клеточной стенки и ранних клеточных делений протопластов листового мезофилла N. tabacum cv. Xanthi (УФ-ви-зуализация после окрашивания тинопалом). А. Свежевыделенные протопласты (Х400). Б. После одного дня культивирования протопласты обнаруживают незначительную флуоресценцию, обусловленную малым количеством материала регенерирующей клеточной стенки (Х325). В. Протопласты после 5 дней культивирования: видна формирующаяся клеточная пластинка (Х583). Г. После семи дней культивирования протопласты претерпевают первое клеточное деление (XI142). Д. Увеличение размеров клетки после первого деления — девять дней культивирования (Х909). Е. Протопласты после десяти дней культивирования: формирование клеточной пластинки перед вторым делением (Х440). Ж¦ Небольшая колония после 14 дней культивирования (Х600).
Рис. 8. Последовательные этапы миотического деления протопластов листового мезофилла N. tabacum cv. Xanthi на ранних стадиях культивирования (УФ-ви-зуализация после окрашивания акридиновым оранжевым). А. Свежевыделенный протопласт с одним хорошо заметным ядром (показано стрелкой) (Х600). Б. После трех дней культивирования протопласты имеют уже сформировавшуюся клеточную стенку, однако в каждой клетке пока заметно только одно ядро (Х370). В. Жизнеспособный протопласт после четырех дней культивирования: ядро неразличимо (ХбЗЗ). Г. Протопласты после первого митотического деления — приблизительно шесть дней культивирования (X1222). Д. Через восемь дней культивирования в протопластах, претерпевших первое митотическое деление, хорошо видны два ядра (Х1000). Е. После второго митотического деления (приблизительно десять дней культивирования) видны четыре ядра < X1333). Ж¦ Результат третьего митоза — небольшая колония после 12 дней культивирования (XI028).
Таблица 14. Получение протопластов из клеток табака
1. Срежьте практически полностью распустившиеся листья двухмесячного растения табака.
2. Простерилизуйте листья, погрузив их на 20 мин в 10%-ный (по-объему) раствор гипохлорита натрия, и затем промойте их 5 раз в стерильной водопроводной воде.
3. Дайте листьям слегка подвянуть в стерильном ламинарном боксе и затем удалите при помощи тонкого пинцета нижний эпидермис.
4. Кусочки обработанного таким образом листа поместите в чашку Петри диаметром 14 см с 30 мл среды CPW 13М'> так, чтобы оголенный мезофилл контактировал со средой; на этой стадии происходит плазмолиз клеток.
5. Когда вся поверхность жидкости окажется покрытой кусочками, листьев, замените среду CPW 13М 20 мл ферментной смеси2>. Инкубируйте чашку в темноте при 25 °С в течение ночи (16—18 ч).
6. Освободите протопласты, мягко покачивая чащку с кусочками гидролизованных листьев. Наклоните чашку и стерильным пинцетом удалите из-суспензии протопластов крупные остатки листьев. Пропустите суспензию через стерильный фильтр с размером пор 64—100 мк.
7. Перенесите суспензию в центрифужную пробирку с винтовой крышкой' (16-20 мм, Corning) и центрифугируйте при 100 g в течение 5 мин.
8. Осадок протопластов аккуратно ресуспендируйте при помощи пастеровской пипетки в среде CPW 13М и снова открутите при 100 g в течение 5 мин. На этой стадии целесообразно отделить интактные протопласты от разрушенных протопластов и клеток. Для этого ресуспендируйте осадок протопластов в среде CPW 21S1' и центрифугируйте суспензию в течение 10 мин при 150 g. В процессе центрифугирования интактные протопласты сформируют тонкий слой материала на поверхности среды 21S*1*, а более плотные разрушенные протопласты и клеточные обломки осядут на дно-пробирки. Протопласты отбирают пастеровской пипеткой и перед тем, как продолжать работу, разводят средой MSP1 9 М. Следует, однако, заметить, что многие типы протопластов чувствительны к инкубации в растворах с высоким содержанием сахарозы, а некоторые их типы оказываются просто слишком плотными, чтобы флотировать. Таким образом, в ряде случаев описанная дополнительная очистка протопластов невозможна.
9. Промойте протопласты дважды, ресуспендируя их в среде MSP1 9М и осаждая на центрифуге.
10. После последнего центрифугирования осадок ресуспендируйте в 10 мл (или в другом известном объеме) среды MSP1 9М и при помощи гемоци-тометра подсчитайте число живых протопластов. Живые протопласты имеют правильную сферическую форму и интактные хлоропласты (овальной формы), которые случайным образом распределены в цитоплазме. Нежизнеспособные протопласты часто бывают неправильной формы, с деформированными хло-ропластами, которые группируются у одного края клетки.
Предыдущая << 1 .. 149 150 151 152 153 154 < 155 > 156 157 158 159 160 161 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed