Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Селекцию колоний трансформированных растительных клеток можно проводить либо на среде, не содержащей фитогормона,— в случае сжс+-векторов, либо на среде с высоким содержанием антибиотика, который в норме токсичен для клеток,—-в случае ожг'-векторов, несущих доминантные селективные маркеры (например, ген устойчивости к канамицину) (рис. 9). Здесь следует остановиться на некоторых принципиальных моментах, касающихся условий селекции. Во-первых, микроколо-.нии должны обладать достаточным размером, чтобы их можно
Генетическая инженерия растений
351
Таблица 17. Совместное культивирование протопластов с Agrobacterium
1. Когда 20—30% клеточной популяции вступит в первое деление (рис. 7, Г), промойте протопласты жидкой средой MSP1 7М и пересейте на эту же агаризованную среду. Обычно к этой процедуре приступают через
3—10 дней после получения протопластов в зависимости от конкретного препарата. На данной стадии большая часть клеточной популяции заканчивает первое деление ядра и находится в фазе G1 второго деления, готовясь начать репликацию ДНК (рис. 8, Г). Нормальный процесс развития протопластов N. tabacum показан на рис. 7 и 8.
2. При помощи пастеровской пипетки добавьте три капли ночной культуры Agrobacterium к препарату протопластов. При этом на каждую растительную клетку приходится около 100 бактерий.
3. Инкубируйте в условиях слабой освещенности (600 люкс) при 25 °С в течение 40 ч. За это время растительные клетки и бактерии склеятся вместе, образовав единый слой, в котором растительные клетки связаны друг с другом бактериальными агрегатами.
4. Разъедините агрегированные растительные клетки путем мягкого пи-петирования пастеровской пипеткой и затем осадите их центрифугированием при 100 g в течение 5 мин. Ресуспендируйте осадок клеток в среде MPS1 7 М, содержащей 1 мг/мл карбенициллина или другой подходящий антибиотик, и еще раз отцентрифугируйте.
5. Ресуспендируйте клетки для высева в 6 мл жидкой среды MSP 7 М, содержащей подходящий антибиотик (например, карбенициллин в концентрации 1 мг/мл), и высейте клетки на 12 мл этой же агаризованной среды (0,8%-ный агар). Для того чтобы ингибировать рост агробактерий, можно использовать те же концентрации антибиотиков, которые применяются для очистки корончатых галлов (раздел 3.1.2).
6. После 7—10-дневного периода роста перенесите растительные клетки на.среду MSP1 ЗМ с антибиотиком и инкубируйте еще в течение недели.
было высевать при низкой плотности. Высев при высокой плотности приводит к тому, что колонии врастают друг в друга; это осложняет отбор клонов и, кроме того, вызывает проблемы, связанные с перекрестным обменом метаболитами. Во-вторых,, условия селекции должны быть таковы, чтобы массовый некроз нетрансформированного материала не ингибировал прорастание трансформированных колоний. Следовательно, первичную селекцию желательно проводить на среде, содержащей пограничные ингибирующие концентрации антибиотика, в особенности если протопласты демонстрируют невысокую жизнеспособность. Предполагаемых трансформантов можно затем отобрать и перенести на среду, которая содержит желаемые количества селективного агента. В-третьих, надо иметь в виду, что наследственная устойчивость растительной колонии к токсическому действию антибиотика часто повышается с увеличением ее размера (возраста!). Методика селекции опс+-трансформантов на среде, не содержащей фитогормонов (MSO), приведена в табл. 18. Методика селекции опс--трансформантов, экспрессирующих устойчивость к канамицину, приведена в табл. 19; в качестве примера взят вектор, экспрессия которого в колониях клеток табака обеспечивает их устойчивость к канамицину при его концентра-
Рис. 9. Рост колоний после четырехнедельного культивирования на среде без гормона. Пятьдесят колоний приблизительно 1,5—2,0 мм в диаметре высеяли в 9 см пластиковой чашке Петри на 30 мл среды MSO, содержащей 1 мг/мл карбенициллина, Л. Колонии, образованные неинфицированными протопласта-мии P. parodii. Б. Колонии, образованные протопластами P. parodii, которые были инфицированы (через семь дней после получения) A. tumefaciens pTiAch5 (107/мл, инкубация в течение 36 ч).
Генетическая инженерия растений
¦353
Таблица 18. Селекция огас+-трансформантов на среде, не содержащей фитогормонов
1. Перенесите 16—30-дневные колонии (в зависимости от интенсивности роста протопластов, см. п. 6, табл. 17) в центрифужные пробирки и промойте их 12 мл среды MSO1’, содержащей 0,5 мг/мл карбенициллина. Подсчитайте число колоний в 1 мл.
2. Внесите колонии при плотности 500 колоний на 1 мл в 8 мл расплавленного и охлажденного до 40 °С MSO-агара, содержащего 0,5 мг/мл карбенициллина, и наслоите его на чашку Петри диаметром 9 см, залитую 10—15 мл этой же среды. Для менее жизнеспособных систем (по сравнению с протопластами табака) при приготовлении твердой среды MSO вместо агара лучше использовать легкоплавкую агарозу.
3. Отберите колонии, которые растут на среде MSO без гормонов в присутствии 0,25 мг/мл карбенициллина или соответствующих количеств других
