Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
9. Когда осадок полностью растворится, добавьте 2 объема (800 мкл) этанола, перемешайте и поместите на —20 °С на ночь.
10. Осадите нуклеиновые кислоты центрифугированием в микроцентри-фугс в течение 2 мин и промойте осадок 1 мл 65%-ного этанола в течение 1 мин. Удалите этанол и повторите промывку дважды, после чего промойте осадок аналогичным образом 85%-ным этанолом. В том случае, если осадок отделится от стенки пробирки, повторите центрифугирование. Промывка этанолом позволяет освободиться от СТАВ и делает препарат ДНК пригодным для обработки рестриктазами.
11. Высушите осадок в вакуумном эксикаторе и растворите в 85 мкл стерильной воды.
12. 10 мкл этого раствора можно использовать для определения концентрации нуклеиновой кислоты с помощью дифениламинового микротеста (см. табл. 24).
13. Соответственно разведите или сконцентрируйте препарат для получения требуемой концентрации (например, 200—500 мкг/мл). Полученная ДНК пригодна для обработки рестрикционными эндонуклеазами и блот-гибридизационного анализа по Саузерну (см. разд. 5). Присутствующая в препаратах РНК не мешает анализу ДНК, поскольку в большинстве случаев она выходит из геля в ходе электрофореза.
!) См. примечание к табл. 21
364
Глава 4
Таблица 24. Количественное определение ДНК с дифениламином
1. Приготовьте следующие растворы:
A. 3N перхлорная кислота. Возьмите 49,2 мл перхлорной кислоты и добавьте дистиллированной воды до 200 мл. Полученный раствор перемешайте и храните в закрытой посуде в вытяжном шкафу. 3N перхлорная кислота — очень едкое вещество, поэтому при обращении с ней необходимо соблюдать особую осторожность. Раствор хорошо сохраняется при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
Б. Раствор дифениламина. Приготовьте 4%-ный раствор дифениламина, содержащий 0,01%-ный паральдегид, в ледяной уксусной кислоте. Все компоненты этого раствора относятся к вредным веществам, в особенности дифениламин, поэтому работать следует в вытяжном шкафу:
а) в конической колбе на 250 мл смешайте 20 мкл паральдегида и 198 мл ледяной уксусной кислоты;
б) аккуратно взвесьте (используйте перчатки) 8 г дифениламина, внесите навеску в раствор паральдегида в уксусной кислоте и быстро оберните колбу алюминиевой фольгой, чтобы защитить раствор от света. Встряхивайте до тех пор, пока весь дифениламин не растворится. Этот раствор можно хранить в течение 6 нед при комнатной температуре в темноте; колбу или кислотницу с раствором следует держать в вытяжном шкафу.
2. Смешайте компоненты реакционной смеси в указанном порядке (работайте под тягой); для этой цели удобно использовать пробирки для микроцентрифуги.
140 мкл стерильной дистиллированной воды
10 мкл раствора ДНК 150 мкл 3N перхлорной кислоты 180 мкл раствора дифениламина
3. Закройте пробирку, перемешайте содержимое, перевернув ее несколько раз, и инкубируйте в темноте при 30 °С в течение 16—20 ч. Важно точно выдерживать одинаковое время и температуру инкубации во всех экспериментах, иначе калибровочную кривую с использованием стандартных растворов ДНК придется строить каждый раз заново.
4. Измерьте оптическую плотность раствора при 600 нм, используя микрокюветы, и соотнесите результат с калибровочной кривой, построенной с помощью серии стандартных разведений ДНК. Количественное определение ДНК следует проводить в присутствии отрицательного контроля (дистиллированная вода без ДНК) для установки нуля спектрофотометра.
В интервале концентраций ДНК от 5 до 50 мкг/мл наблюдается линейная зависимость между концентрацией и ОПвоо. Для более концентрированных растворов линейная зависимость нарушается; в этом случае следует использовать соответствующие разведения.
Конкретные технические приемы различаются в разных лабораториях, но практически все методики включают измельчение свежего растительного материала, фракционирование субклеточных структур путем дифференциального центрифугирования, ДНКазную обработку интактных органелл, лизис, депротеини-зацию и, наконец, очистку нуклеиновых кислот в градиентах плотности CsCl/EtBr. В данном разделе мы планировали дать общее описание методических приемов, которые могли бы послужить отправными точками в разработке конкретных экспериментальных процедур для выделения ДНК из того или иного источника.
Таблица 25. Выделение ядерной ДНК из свежих листьев или каллуса
1. Взвесьте 200 г ткани и промойте дистиллированной водой при 2 °С в большом стеклянном стакане. Все последующие манипуляции выполняйте яа льду (2—4°С), желательно в холодной комнате.
2. Удалите средние жилки (если используете листья) и бритвой на-'режьте ткань мелкими кусочками. Это удобно делать в большой чашке Петри (14 см).
3. Поместите кусочки ткани в 1 л стакан, залейте диэтиловым эфиром и выдержите 2 мин при помешивании.
4. Удалите эфир, прополосните ткань холодной дистиллированной водой и гомогенизируйте в 400 мл буфера для выделения ядер А1', используя аппарат Polytron; средний скоростной режим—1 мин. Можно использовать и гомогенизатор типа Waring blender — два 5-минутных импульса при средней скорости2*.
