Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
11. Высейте протопласты при плотности суспензии приблизительно
2-105 живых клеток на 1 мл в 5 мл жидкой среды MSP1 9М на чашку диаметром 9 см, предварительно залитую 12 мл агаризованной среды MSP1 9М (0,8%-ного агара). Таким образом, конечная плотность высеваемой суспензии составляет 5 -104 протопластов на 1 мл.
12. Инкубируйте чашку в условиях слабой освещенности (600 люкс) при 25 °С.
') См. табл. 15.
2) Ферментная смесь содержит 0,2% целлюлозы и 0,05% пектиназы в среде CPW 13 М
(см. табл. 15).
Генетическая инженерия растений
34»
Таблица 15. Растворы для получения растительных протопластов
А. Солевая смесь Компонент Содержание Концентра
в 10 л ция (мг/л)-
ЮОХрас-
твора
CPW раствор 1 КН2Р04 2,72 г 27,2^
KN03 10,1 г 101,0
MgS04-7H20 24,6 г 246,0
KI 16 мг ОЛб'
CuS04-5H20 2,5 мг 0,025
CPW раствор 2 СаС12-2Н20 148 г 1480,0
CPW 13М представляет собой 13%-ный (по весу) раствор маннитола в солевой смеси CPW; CPW 9М —9%-ный раствор маннитола; CPW 21S — 21%-ный раствор сахарозы. pH среды доводят до 5,8 и стерилизуют авто-клавированием.
Б. Ферментный раствор для получения протопластов из клеток мезофилла листьев табака
Целлюлоза «Onozuka» R-10 0,2% (по весу)
Мацерозим R-10 0,5% (по весу)
Эти ферменты производит японская фирма Yakult Pharm. Industry Co. Ltd. Растворите оба ферментных препарата в среде CPW 13М, простерилизуйте фильтрованием через мембрану 0,45 мкм и храните при —20 °С.
Таблица 16. Флуоресцентное окрашивание препаратов для контроля за развитием протопластов
А. Визуализация регенерированной клеточной стенки с помощью тинопала
1. Приготовьте насыщенный раствор тинопала (Ciba Geigy UK Ltd.) в дистиллированной воде и храните его в темноте при 4 °С.
2. Не взбалтывая насыщенный раствор, чтобы не поднять со дна не-растворившиеся частицы красителя, добавьте 0,1 мл его к 20 мл среды CPW 9М и перемешайте. Эту смесь можно стерилизовать фильтрованием и хранить в холодильнике в течение двух месяцев.
3. Смешайте одну каплю рабочего раствора тинопала (см. п. 2) с каплей суспензии протопластов на чистом предметном стекле и накройте покровным стеклом.
4. Оставьте на 5 мин при комнатной температуре.
5. Проанализируйте препарат под микроскопом, снабженным эпифлуорес-центной приставкой (например, Nicon Optiphot, XF-EF1)) с УФ-фильтром возбуждения, имеющим полосу пропускания 330—380 нм (Nicon excitation filter cassette U; 365 nm в сочетании с дополнительным УФ-фильтром возбуждения 330—380), и с барьерным фильтром, выделяющим составляющую флуоресценции в области 420 нм (Nicon eyepiece-side absorbtion filter 420 К). Пример окрашенного тинопалом препарата протопластов приведе» на рис. 7.
Б. Визуализация ядер с помощью акридинового оранжевого
1. Растворите 10 мг акридинового оранжевого (Sigma) в 4 мл 50 мМ. глицин^аОН-буфера pH 8,5 и смешайте с 6 мл среды CPW 13М. Храните при 4°С в темноте.
.350
Глава 4
Продолжение
2. Добавьте каплю раствора красителя к 3 мл суспензии протопластов и инкубируйте в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин.
3. Промойте протопласты дважды, центрифугируя препарат при 100 g в течение 5 мин и ресуспендируя его в среде CPW 9 М.
4. Проанализируйте препарат в УФ-микроскопе, используя синий фильтр возбуждения1* (Nicon excitation filter cassette code В, 495 в сочетании с дополнительным фильтром возбуждения 460) и барьерный фильтр, выделяющий составляющую флуоресценции в области 515 нм (Nicon eyepiece-side absorbtion filter 515 W). Пример окрашенного акридиновым оранжевым препарата протопластов приведен на рис. 8.
*) Указанное оборудование фирмы Nicon использовалось авторами; допустимы любые эквивалентные замены.
тографии, приведенные на рис. 7, представляют различные стадии биосинтеза клеточной стенки и раннего клеточного деления; рис. 8 демонстрирует различные стадии митотической активности в протопластах N. tabacum cv. Xanthi. Процедура приготовления протопластов описана в табл. 14. Растворы, необходимые для этой процедуры, приведены в табл. 15, а методики окрашивания и визуализации протопластов даны в табл. 16.
3.3.2. Совместное культивирование протопластов и Agrobacterium и селекция колоний трансформантов
Культуру протопластов следует регулярно контролировать, используя инверсионный микроскоп. Отметьте, когда произойдут первые клеточные деления. Микроскопический анализ можно упростить, окрашивая небольшие образцы препарата флуоресцентными красителями типа Тинопал (Tinopal), которые связываются с целлюлозосодержащими материалами и позволяют визуализировать новообразованные клеточные стенки и клеточные пластинки при ультрафиолетовой микроскопии (см. табл. 16,Л). Развитие протопластов можно также контролировать, наблюдая за делением ядер, окрашенных акридиновым оранжевым, в УФ-микроскопе (табл. 16,5). Когда 20—30% клеточной популяции вступит в первое деление, протопласты готовы для совместного культивирования с Agrobacterium-, соответствующие экспериментальные процедуры описаны в табл. 17.
