Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
344
Глава 4
Таблица 12. Инфицирование A. tumefaciens
1. Срежьте стерильным скальпелем верхушки растений, культивируемых in vitro, или стерильных сеянцев или используйте свежие стеблевые эксплантаты.
2. Нанесите на поверхность среза петлей ночную культуру онкогенногс штамма A. tumefaciens (см. рис. 6, Л). Другой вариант — уколоть стебель растения иглой для подкожных инъекций, предварительно смоченной ночной культурой A. tumefaciens.
3. Инкубируйте инфицированные растения в течение 3—6 нед при 25 °С в условиях умеренного освещения (600—1000 люкс).
4. Отделите опухоли, когда они достигнут 3—10 мм в диаметре, и поместите на среду MSO 1C1) (5 мл среды в пластиковой чашке Петри диаметром 5 см). Среда MSO 1C содержит антибиотик карбенициллин в концентрации 1 мг/мл, который вызывает гибель агробактерий, не имеющих активного гена ^-лактамазы (Ар1). Альтернативные варианты применения антибиотиков для уничтожения бактерий в опухолях включают2); рифампицин (50 мкг/мл) в сочетании с тетрациклином (10 мгк/мл), цефотаксим (500 мкг/мл), ванкомицин (100 мкг/мл).
5. Перенесите ткань через 3—6 нед (в зависимости от ростового статуса изолированной опухоли) на среду MSO, содержащую 0,5 мг/мл карбени-циллина, и далее продолжайте культивирование на среде MSO, содержащей
0,25 мг/мл карбенициллина. Если карбенициллин не подходит, используйте среды с последовательно снижаемым содержанием других антибиотиков.
6. Периодически проверяйте стерильность опухоли путем инкубирования маленьких кусочков в питательной среде в течение двух дней при 25 “С в условиях интенсивной аэрации. Когда в опухоли не останется жизнеспособных бактерий, можно перенести ее на среду MSO без антибиотика.
') Рецептура сред приведена в табл. 9.
2) Приготовление растворов антибиотиков описано в табл. 10.
словленная активностью фермента неомицинфосфотрансферазы (NPTII). Структурный ген NPTII, находящийся под контролем nos-промотора (см. разд. 2), способен обеспечить устойчивость клеток, побегов и сеянцев к канамицину при его концентрации в среде 500 мкг/мл и даже выше [9]. Методика такой доминантной селекции приведена в табл. 13. Методические приемы для осуществления прямой регенерации трансформированных побегов, экспрессирующих доминантные маркеры, описаны в разд. 3.5.
Таблица 13. Доминантная селекция трансформированного каллуса
1. Приготовьте стеблевые эксплантаты или усеченные сеянцы и проведите их заражение, как описано в табл. 12.
2. Инкубируйте в течение 2—3 нед при 25 °С и интенсивности освещения 600—1000 люкс. Отделите зараженную верхушку стебля, срезав ее на расстоянии 1—2 мм от поверхности исходного среза (см. рис. 6, Б).
3. Поместите зараженный эксплантат на подходящую среду для индукции каллуса; среда должна содержать антибиотик для уничтожения агробактерий (см. табл. 12). Состав среды зависит от вида растения. Для табака, например, используется среда MSP1.
4. После индукции каллуса отделите кусочки ткани (если необходимо, воспользуйтесь скальпелем) и поместите эти кусочки на селективную среду, например MSP1, содержащую канамицин в концентрации 100 мкг/мл.
Генетическая инженерия растений
345
3.3. Трансформация растительных клеток
при совместном культивировании с Л. tumefaciens
Вызывая образование корончатых галлов, Agrobacterium трансформирует клетки, окружающие поврежденный участок ткани, именно те клетки, которые приступили к делению в ответ на повреждение (раневой ответ). Клетки интактного растения обнаруживают максимальную чувствительность к трансформирующему действию A. tumefaciens в интервале между 1,5 и
2 днями после повреждения. У некоторых видов эта компетентная фаза коррелирует с пиком клеточных делений, сопровождающих раневой ответ. Показано [24], что раневой ответ можно имитировать в культуре. Для этого необходимо протопластиро-вать покоящиеся клетки мезофилла листа или активно делящиеся культивируемые клетки и затем дать возможность протопластам регенерировать клеточную стенку и приступить к делению на подходящей среде. На определенной стадии совместного культивирования с A. tumefaciens можно получить клональные колонии трансформантов. Необходимо ясно представлять, что корончатые галлы являют собой смесь нетрансфор-мированных и нескольких типов независимо трансформированных клеток, поэтому фенотип опухоли по сути представляет сумму фенотипов всех входящих в нее типов клеток. В то же время трансформанты, полученные в результате совместного культивирования, в норме содержат только один тип трансформированных клеток; это исключает фенотипическое маскирование и значительно уменьшает вероятность ошибочных результатов при скрещивании и последующем анализе. Колонии трансформантов можно отбирать по способности к гормоннезависимому росту— в случае опс+-векторов или путем селекции на средах, содержащих антибиотики,— в случае опс~-векторов, несущих доминантные селективные маркеры (такие, например, как устойчивость к канамидину).
