Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
5. Профильтруйте гомогенат через 4 слоя стерильного муслина и один слой Miracloth (Calbiochem) в 1 л стерильный стакан.
6. Перенесите гомогенат в большие стерильные центрифужные стаканы и центрифугируйте при 2000 g в течение 10 мин (4°С) для получения грубого препарата клеточных ядер2*.
7. Полученные осадки ресуспендируйте в 25 мл буфера для промывки ядер В3>, используя стерильный гомогенизатор Поттера (Jencons), и центрифугируйте в силиконированной стерильной пробирке Corex (Corning) в ба-кет-роторе при 2000 g в течение 10 мин при 4°С. Повторяйте промывку и центрифугирование до тех пор, пока препарат ядер не освободится от клеточных обломков (3—4 промывки).
8. Если требуется ультрачистый препарат, ядра можно дополнительно пропустить через ступенчатый градиент плотности Percol. Ресуспендируйте ядра в 7 мл буфера для выделения ядер А и наслоите на ступенчатый градиент, приготовленный из 7 мл 35%-ного раствора и из 7 мл 80%-ного раствора Percol (Pharmacia) в буфере для выделения ядер А, в стерильной силиконированной пробирке Согех. Центрифугируйте в бакет-роторе при 8000 g в течение 30 мин при 4 °С. Ядра, освобожденные от клеточных обломков, собираются в зоне между двумя ступенями градиента. Эту зону отбирают и разбавляют 25 мл буфера для выделения ядер А. Затем ядра осаждают центрифугированием (2000 g, бакет-ротор) и один раз промывают в том же буфере. Очищенный препарат ядер хранят в соответствующем буфере4) при —70 °С.
9. Ресуспендируйте ядра на льду в 5 мл специального буфера5) (этот буфер не содержит осмотически активного компонента), разрушьте ядра с помощью встряхивателя: 10 циклов по 5 с в течение 5-мин, между циклами охлаждайте препарат во льду6).
10. Добавьте 0,1 мл 2-меркаптоэтанола, затем 5 мл 2Хбуфера для экстракции7), нагретого до 95 °С, и немедленно перемешайте пластиковой палочкой. Далее проведите выделение ДНК> руководствуясь методикой, применяемой для лиофилизированного растительного материала (табл. 21, начиная со стадии 4).
') Буфер для выделения ядер А: 1 М сахароза; 10 мМ трис-НС1 pH 7,2; 5 мМ MgCb;
2 мМ 2-меркаптоэтанол (2МЭ). Раствор готовят и автоклавируют без 2МЭ; 2МЭ добавляют в стерильный буфер непосредственно перед нспользованяем.
2) См. обсуждение этой стадии в тексте.
3) Буфер для промывки ядер В идентичен буферу А (см. примечание 1), но содержит дополнительно 0,9% Тритон Х-100.
*) Буфер для хранения ядер; 250 мМ сахароза; 20 мМ HEPES pH 7,8; 5 мМ MgCI2; 1 мМ дитиотрейтол; 50% глюкоза.
5) Буфер для лизиса ядер С: 10 мМ трис-НС1 pH 7,2; 10 мМ ЭДТА; 5 мМ 2МЭ-0,5% тритон Х-100.
5) Выход ДНК можно повысить за счет замораживания — оттаивания осадка ядер и протеазной обработки лнзированиых ядер в течение 30 мии при 37 °С в 5 мл буфера для лизиса С, содержащего 500 мкг/мл прегидролизованной проназы.
7) См. примечание 1 к табл. 21.
366
Глава 4
Таблица 26. Выделение ДНК из хлоропластов и митохондрий
1. Гомогенизируйте 200 г растительного материала по методике, приве* денной в табл. 25 (стадии 1—5), используя вместо буфера А буфер для выделения органелл F1).
2. Осадите ядра центрифугированием при 100 g в течение 10 мин при 4°С.
3. Отберите надосадочную жидкость и центрифугируйте при 1800 g (4 °С, 10 мин), чтобы собрать хлоропласты. Осадок хлоропластов поместите на лед, а надосадочную жидкость перенесите в чистый центрифужный стакан.
4. Центрифугируйте при 10 000 g в течение 15 мин при 4 °С, чтобы собрать митохондрии.
5. Ресуспендируйте каждый из осадков (хлоропластов и митохондрий) в 25 мл ДНКазного буфера G2> и инкубируйте на льду (0°С) в течение 1 ч, время от времени перемешивая суспензии. Концентрация ДНКазы подбирается эмпирически так, чтобы исключить загрязнения препарата ДНК органелл ядерной ДНК- Успешно апробированный интервал концентраций ДНКазы составлял от 150 до 500 мкг/мл [33].
6. Добавьте ЭДТА (pH 8,0) до концентрации 10 мМ, чтобы остановить реакцию.
7. Осадите хлоропласты и митохондрии центрифугированием соответственно при 1800 g и 10 000 g в течение 15 мин при 4 °С.
8. Ресуспендируйте каждый из осадков в 7 мл буфера F (при необходимости воспользуйтесь гомогенизатором Поттера) и проведите дополнительную очистку препаратов органелл путем центрифугирования в ступенчатом градиенте плотности Percol, как описано в табл. 25 (стадия 6).
9. Разбавьте митохондриальную фракцию и фракцию хлороропластов. 25 мл буфера F и центрифугируйте их соответственно при 1800 g и 10 000 g в течение 15 мин при 4°С.
10. Промойте полученные препараты, ресуспендировав каждый в 25 мл буфера Н3), и снова осадите органеллы центрифугированием.
11. Заморозьте осадки в спиртовой бане с сухим льдом и затем дайте им оттаять на водяной бане при 22 °С. Повторите цикл замораживание/оттаивание три раза и затем ресуспендируйте осадки в 5 мл буфера, используемого при выделении ядерной ДНК (это буфер для лизиса ядер С4)).
