Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Раствор 5 H3B03 62 мг 6,2
MnS04-H20 1,7 мг 0,17
ZnS04-7H20 2,8 мг 0,28
СоС12-6Н20 0,25 мг 0,025
CuS04-5H20 0,25 мг 0,025
Na2Mo04-2H20 0,24 мг 0,024
Компоненты, добавляемые непосредственно в готовую среду
Пиридоксин 180,0
NAA 0,1
6ВАР 1,0
Сахароза 20 000,0
pH 5,6
Перед использованием в эту среду необходимо внести глутамин до 2 мМ. Глутамин растворяют в дистиллированной воде до концентрации 23,36 мг/мл, стерилизуют фильтрованием н хранят при —20°С. Добавляют 1,2 мл раствора в жидкую или расплавленную агаризованную среду (при 45°С). Концентрированный раствор пиридоксина готовят, растворяя его в дистиллированной воде до концентрации 5 мг/мл. Агаризованные среды содержат 8 г/л агара.
можность заключается в отборе эксплантатов из тепличного материала с последующей опухолевой индукцией in vitro, при этом строго контролируется стерильность препарата. Для обеспечения стерильности все работы с растительным материалом следует проводить в ламинарном боксе, используя только авто-клавированные инструменты и среды. Рецепты сред для культивирования растительных тканей приведены в табл. 9; применяемые антибиотики описаны в табл. 10. Приготовление эксплантатов и их инфицирование A. tumefaciens описаны в табл. 11 и 12. Схематически процедура инфицирования представлена на рис. 6.
3.2. Трансформация эксплантатов с помощью one -векторов,. содержащих доминантные селективные маркеры
На сегодняшний день наиболее широко используемым доминантным селективным маркером трансформации является устойчивость к аминогликозидному антибиотику канамицину, обу-
Таблица 10. Антибиотики, используемые при культивировании растительных тканей
Карбенициллин
(Sigma)
.Цефотаксим (Hoechst)
Канамицин
(Sigma)
.Рифампицин
(Sigma)
Тетрациклин
(Sigma)
Растворите в дистиллированной воде (100 мг/мл) и стерилизуйте фильтрованием. Раствор можно хранить при 4°С в течение 1 месяца или заморозить при —20 °С
Растворите в дистиллированной воде (50 мг/мл) и стерилизуйте фильтрованием. Храните при —20 °С. Цефотаксим в культуральной среде разлагается на свету приблизительно за три недели Растворите в дистиллированной воде (10 мг/мл) и стерилизуйте фильтрованием. Храните при 4 °С в течение месяца или заморозьте при —20 °С Растворите в метаноле (20 мг/мл). Для этого взвесьте нужное количество рифампицина в стерильном флаконе, добавьте метанол, закройте флакон и встряхните, чтобы антибиотик растворился. Храните при —20 °С в течение трех месяцев
Растворите в дистиллированной воде (10 мг/мл) и стерилизуйте фильтрованием. Храните при 4 °С в течение месяца или заморозьте при —20 °С
Таблица 11. Приготовление растений для инокуляции
А. Из стерильных сеянцев
1. Проведите поверхностную стерилизацию семян в 10%-ном (по объему) растворе гипохлорита натрия (конечная концентрация активного хлора должна составлять около 1%). Продолжительность стерилизации зависит ¦от вида семян, однако в среднем достаточно 10—30 мин. Если семена имеют восковую кутикулу, ворсистую поверхность или поверхность с развитым рельефом перед стерилизацией, их можно в течение 5—10 с промыть в 10%-ном этаноле.
2. Промойте семена в пяти сменах стерильной водопроводной воды. Если семена мелкие, удобно поместить их в нейлоновую марлю или нейлоновое или стальное сито (например, чайное ситечко).
3. Прорастите семена на агаризованной (0,8%) среде MSO‘>. Инкубируйте культуральные сосуды2) при 25 °С в условиях умеренного освещения (1000 люкс).
Б. Из эксплантатов
1. Отрежьте молодые побеги от выращенных в тепличных условиях растений и простерилизуйте их поверхностно в 10%-ном (по объему) растворе гипохлорита натрия в течение 20—30 мин.
2. Промойте побеги в пяти сменах стерильной водопроводной воды.
3. Используя в качестве подставки стерильную стеклянную пластину, белую глазурованную кафельную плитку или большую чашку Петри, с помощью стерильного скальпеля удалите с побегов все ткани, разрушенные хлорной известью. Срежьте крупные нижние листья и нарежьте побеги на кусочки длиной 4 см (или такого максимального размера, чтобы они по высоте помещались в культуральный сосуд).
4. Вставьте эксплантаты базальным концом в агаризованную среду MSO.
*) Все среды, используемые при культивировании растений, описаны в табл. 9.
2) Удобные культуральные сосуды — флаконы «Universal» или «Powder Round Jars» фирмы Beatson Clark and Co. Ltd. В один флакон «Universal» заливайте 6 мл среды, а во флакон «Powder Round Jars» — 40 мл среды.
