Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
цию созданных in vitro генетических конструкций в геном двудольных растений, где эти конструкции в принципе могут успешно экспрессироваться. Были разработаны различные векторные системы на базе Ti-плазмид (разд. 2). В некоторых таких системах (опс+) используются естественные онкогенные свойства Ti-плазмидной Т-ДНК, которая индуцирует у растения развитие опухоли. В других векторах (опс~) ген otic удален из Т-ДНК, и вместо него введен доминантный селективный маркер, который позволяет отбирать рекомбинантные, но не претерпевшие опухолевой трансформации клетки. Основной недостаток Ti-плазмидных систем заключается в том, что вирулентные штаммы A. tumefaciens, по всей видимости, не способны трансформировать однодольные растения. В данном разделе мы намерены описать основные методические приемы, которые позволяют успешно трансформировать растительные клетки опс+- и опс--векторами с использованием вирулентных агробактерий для введения ДНК в растительные клетки. Далее мы вкратце коснемся некоторых систем, которые предполагают введение свободных ДНК-векторов в растительные протопласты. И в заключение мы рассмотрим комбинации векторных систем и различных систем «доставки» ДНК в растительные клетки в отношении их влияния на регенерацию трансформированных растений и стабильность введенных генов в мейозе.
22*
340
Глава 4
3.1. Индукция опухолей у стерильных сеянцев и эксплантатов вирулентными и онкогенными агробактериями
Для большинства видов растений наиболее подходящий материал для опухолевой индукции — стерильные сеянцы или ткань, культивируемая in vitro. Использование стерильного растительного материала является весьма важным моментом и позволяет избежать загрязнения трансформированной растительной ткани микроорганизмами, отличными от агробактерий. В противном случае зараженная среда культивирования может оказаться гибельной для растительных клеток. Кроме того, присутствие посторонней микрофлоры может исказить результаты молекулярно-биологических и биохимических исследований, проводимых на трансформированном материале. Если семена или размножаемый материал недоступны, в некоторых случаях допускается инокулировать растения in vivo. Альтернативная воз-
А.
Трансформация one -векторами
Вырезание зараженного участка
Индукция in vitro каллуса на соответствующей среде
Измельчение ткани и селекция трансформантов на среде, содержащей нанамицин
Рис. 6. Схема, иллюстрирующая методы введения в растительные ткани ояс+* и олс~-векторов на основе Ti-плазмид.
Таблица 9. Среды для культивирования растений
А. Солевой состав среды. (MS) [39]
1. MSO
Компонент Количество
СаС12-2Н20 0,44 г
NH4NO3 1,65 г
KN03 1,90 г
KI 0,83 мг
СоС12-6Н20 0,025 мг
КН2Р04 0,17 г
H3B03 6,2 мг
Na2Mo04-2H20 0,25 мг
MgS04-7H20 0,37 г
MnS04-4H20 22 мг
CuS04-5H20 0,025 мг
ZnS04-7H20 8,6 мг
РеИаЭДТА 36,7 мг
Глицин 2 мг
Инозитол 0,1 г
Никотиновая кислота 0,5 мг
Пиридоксин-НС1 0,5 мг
Тиамин-НС1 0,1 мг
Сахароза 30 г
Доведите pH до 5,6 0,1 М НС). Все вышеперечисленные компоненты, за исключением сахарозы, поставляются фирмой Flow Labs расфасованными и взвешенными.
2. MS О 1C
Добавьте карбенициллин к расплавленной среде MSO (при 45 °С) до концентрации 1 мг/мл. Для этого удобно использовать стерилизованный фильтрованием концентрированный раствор карбенициллина (100 мг/мл).
3. MSPI
В состав этой среды помимо всех компонентов среды MSO входит: NAA (нафалинуксусная кислота) 2,0 мг/л 6ВАР (6-бензиламинопурин) 0,5 мг/л
Растворите 500 мг NAA в 20 мл 50%-ного этанола; добавьте 80 мкл к 1 л MSO. Растворите 126 мг 6ВАР в 1 мл 1 М НС1 и прилейте 99 мл дистиллированной воды; добавьте 400 мкл к 1 л MSO.
4. MSPI 9 М, 7 М, ЗМ
Добавьте необходимое количество маннитола (9, 7 или 3% по весу) к MSP1, перед тем как довести ее объем до конечной величины. Для MSP1 9, 7 и ЗМ это составит соответственно 90, 70 и 30 г/л. Если необходимо, в среду добавляют агар до 0,8% (8 г/л). Обычно агар растворяют, нагревая среду перед тем, как ее автоклавировать.
342
Глава 4
Продолжение
Б. Среда Caboche [40]
Компонент Количество Конечная
в 100 мл концентра
ЮОХрас- ция (мг/л)
твора
100 X растворы NH4NO3 4 Г 400,0
СаС12-2Н20 2,93 г 293,0
Раствор 2 MgS04-7H20 2,46 г 246,0
Раствор 3 FeS04-7H20 0,27 г 27,0
Ыа2ЭДТА 0,37 г 37,0
Раствор 4 КН2Р04 0,68 68,0
