Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 150

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 144 145 146 147 148 149 < 150 > 151 152 153 154 155 156 .. 253 >> Следующая

5. Экстрагируйте препарат равным объемом фенола, уравновешенного 100 мМ трис-НС1 pH 8,0; 0,5 м NaCl.
6. Водную (верхнюю) фазу экстрагируйте равным объемом смеси фенол : хлороформ : изоамиловый спирт (12 : 12 : 1).
7 Водную фазу экстрагируйте равным объемом смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1).
8. Осадите ДНК, добавив к водной фазе два объема этанола (соль можно не добавлять). Охладите препарат до —70 °С в спиртовой бане с сухим льдом и соберите ДНК центрифугированием в микроцентрифуге.
9. Промойте осадок ДНК 70%-ным этанолом, высушите в вакууме и растворите в 200 мкл буфера3*.
') Рецептура сред приведена в табл. 1.
2) ТЕ: 50 мМ трис-НС1 pH 8,0; 20 мМ ЭДТА.
3) Буфер для растворения ДНК: 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 5 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА.
правильную гибридизадионную картину, можно использовать для трансформации растительной ткани, как это описано в разд. 3.
2.3.1. Выделение Ti-плазмидной ДНК A. tumefaciens
Вполне вероятно, что для экспериментальных целей понадобится препарат ДНК Ti-плазмиды. Препаративное выделение Ti-плазмидной ДНК описано ранее [21]. Методика, представленная в табл. 7,— аналитическая процедура, позволяющая получить до 2 мкг плазмидной ДНК из 10 мл культуры. Выделенный препарат ДНК годится для обработки большинством известных в практике рестриктаз, но содержит следовые количества РНК-
2.4. Бинарные векторы для введения чужеродной ДНК
в растения
Бинарные векторы были разработаны после того, как удалось установить следующий факт. Если область vir и область Т-ДНК Ti-плазмиды находятся в двух разных плазмидных ре-пликонах, iur-область, локализованная в одной плазмиде, способна комплементировать в транс-положении функцию переноса Т-ДНК в растения. Преимущество бинарной системы по сравнению с системами, описанными в разд. 2.2, заключается в том,
336
Глава 4
Таблица 7. Аналитическое выделение Ti-плазмидной ДНК
1. Внесите в 100 мл среды YEB1» отдельную колонию и растите культуры при 28 °С на ротационной качалке в интенсивном режиме в течение 20 ч.
2. Возьмите две пробирки для микроцентрифуги, налейте в каждую 1,65 мл культуры и осадите клетки центрифугированием в течение 2 мин. Удалите надосадочную жидкость и налейте в пробирки еще по 1,65 мл культуры, отцентрифугируйте и повторите процедуру еще раз, чтобы в каждой пробирке получить осадок клеток из 5 мл культуры.
3. Ресуспендируйте клетки с помощью микропипетки в 300 мкл буфера STET2).
4. Добавьте 25 мкл свежеприготовленного раствора лизоцима (10 мг/мл), интенсивно перемешайте, встряхнув пробирки, и оставьте при комнатной температуре на 1 мин.
5. Поместите пробирки в плавающий штатив-«плотик» и инкубируйте на кипящей водяной бане в течение 1 мин.
6. Быстро перенесите пробирки в лед и оставьте на 5 мин.
7. Центрифугируйте препараты в течение 10 мин и перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки с помощью микропипетки, используя наконечники, обрезанные на 1 мм от края (увеличенное отверстие снижает вероятность фрагментирования ДНК). Начиная с этого момента для всех последующих манипуляций следует применять наконечники с обрезанными кончиками и стараться избегать активного перемешивания препаратов.
8. Экстрагируйте надосадочную жидкость три раза 400 мкл смеси хлороформ: изоамиловый спирт (24: 1), отбирая каждый раз водную (верхнюю) фазу.
9. Осадите плазмидную ДНК, добавив 300 мкл холодного (—20 °С) изопропилового спирта. Оставьте пробирки на 30 мин при —20 °С. Если осадок не виден, оставьте пробирки при этой температуре на ночь.
10. Центрифугируйте пробирки в микроцентрифуге в течение 2 мин. Удалите спирт, высушите осадок в вакуумном эксикаторе и растворите в стерильной дистиллированной воде; если необходимо, можно нагреть препараты до 56 °С и инкубировать при этой температуре в течение 5—10 мин.
11. Объедините препараты и экстрагируйте равным объемом фенола, насыщенного 100 мМ трис-НС1 pH 8,0 и 0,5 М NaCl. Центрифугируйте в отберите водную (верхнюю) фазу.
12. Повторите экстракцию один раз хлороформом и один раз этиловым эфиром.
13. Нагрейте препарат до 68 °С и инкубируйте в течение 10 мин, чтобы удалить следы эфира3>.
14. Если потребуется, измерьте концентрацию ДНК с помощью дифени-ламиновой реакции (см. разд. 4.1.1) и разведите препарат до нужной концентрации.
') Рецептура сред приведена в табл. 4.
s) Буфер STET имеет следующий состав: 50 мМ трис-НС1 pH 8,0; 50 мМ ЭДТА, 8% (по весу) сахарозы; 5% (по объему) тритона Х-100.
!) Не работайте с эфиром у открытого огня и вблизи электрических выключателей.
что отпадает необходимость конструировать плазмидные коин-теграты. Нельзя, однако, не отметить, что эффективность генетического переноса в экспериментах по совместному культивированию (см. разд. 3) может оказаться ниже, чем в случае челночных векторов [16]. Бинарная векторная система впервые была описана Хёкемой и сотр. [22], которые использовали плазмиду pLA4404 в качестве «проводника» вирулентности.
Предыдущая << 1 .. 144 145 146 147 148 149 < 150 > 151 152 153 154 155 156 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed