Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Генетическая инженерия растений
33?
Рис. 5. Физическая карта pTiAch5, полученная с помощью рестриктаз Smal,, ВатН\ и HindIII. Штриховкой и черным цветом выделены Ti-плазмидные сегменты, присутствующие соответственно в pAL4404 и pAL1050. (Воспроизводится с любезного разрешения авторов работы [23].)
Эта плазмида создана на базе Ti-плазмиды октопинового типа pTiAch5; ее схема представлена на рис. 5.
Итак, первая бинарная векторная система предполагала использование в качестве вспомогательной плазмиды pLA4404, в то время как область Т-ДНК клонировали в плазмидном векторе, обладающем широкой хозяйской специфичностью. Однако последняя конструкция не годится для переноса чужеродных генов в растения. Пока не опубликованы разработки сколько-нибудь подходящих векторов для подобного генетического переноса, однако мы в настоящее время завершаем конструирование такого вектора.
1. Он будет обладать репликативными функциями плазмиды RK2, что позволит ему реплицироваться в Е. coli и A. tumefaciens, а также гарантирует совместимость с Ti-плазмидой.
2. Такой вектор будет содержать ген устойчивости к кана-мицину (nptI) из Тп903 для селекции в бактериях.
22—196
338
Глава 4
3. В его состав будут входить правая и левая граничные последовательности октопиновой Ti-плазмиды для переноса ДНК в растения.
4. Указанные граничные последовательности будут фланкировать состыкованную область nos-neo для селекции растительных трансформантов, а также ffaell-фрагмент плазмиды pUC18, который содержит полилинкер в составе участка гена ^-галак-тозидазы. Нуклеотидная последовательность полилинкера содержит множественные сайты рестрикции, удобные для клонирования интересующего гена. Следовательно, плазмидные рекомбинанты при выращивании на среде, содержащей изопро-пил-1-тио-^-0-галактозид (IPTG) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-^-D-галактозид (X-gal), будут формировать белые колонии (как в случае векторов pEMBL, см. главу 5 в первом томе книги).
После того как получена гибридная конструкция, содержащая вектор переноса ДНК и интересующий ген X, ее необходимо передать из Е. coli в A. tumefaciens путем конъюгации. Поскольку у вектора отсутствуют нужные функции, генетический перенос обеспечивается по транс-схеме плазмидой pRK2013 [23] в триродительском скрещивании, как описано в разд. 2.2.1. В подобном эксперименте в качестве двух донорных штаммов Е. coli выступают НВ101 (pRK2013) и JM83 (вектор переноса ДНК) (табл. 2). Реципиентом служит LA4404, содержащий pLA4404. Эксконъюгантов отбирают на минимальной среде АВ (с селекцией против донора), содержащей канамицин для селекции вектора переноса ДНК. Плазмида pRK2013 также несет ген устойчивости к канамицину, однако она не способна реплицироваться в A. tumefaciens. Новая конструкция теперь готова для трансформации растительной ткани.
2.4.1. Трансформация A. tumefaciens плазмидной ДНК
Альтернативный путь введения вектора переноса ДНК в штамм A. tumefaciens, несущий плазмиду pLA4404, заключается в его прямой трансформации. Соответствующие экспериментальные процедуры описаны в табл. 8.
3. Введение ДНК в растительные клетки и регенерация трансформированных растений
Методические подходы к трансформации высших растений с использованием векторных молекул ДНК были разработаны на протяжении нескольких последних лет. Эти работы явились естественным следствием открытия Ti-плазмид A. tumefaciens и выяснения их роли в этиологии растительных опухолей (корончатых галлов) (см. разд. 2). Вирулентные агробактерии, несущие Ti-плазмиды, способны обеспечить перенос и интегра-
Генетическая инженерия растений
339
Таблица 8. Прямая трансформация A. tumefaciens плазмидной ДНК
1. Внесите отдельную колонию LBA44041' в 5 мл среды LBMG или YEB и растите культуру при 30 °С в течение ночи на качалке.
2. Инокулируйте 200 мл свежей среды ночной культурой и инкубируйте в колбе на 1 л при 30 °С в течение 5—6 ч.
3. Центрифугируйте культуру в роторе Sorvali GSA (или эквивалентном) при 4000 об/мин в течение 5 мин. Затем ресуспендируйте клетки в 100 мл 10 мМ трис-НС1 pH 8,0.
4. Осадите клетки, как это описано в п. 3, и ресуспендируйте их в 12 мл YEB (или LBMG)2).
5. Смешайте 200 мкл клеток и 100 мкл плазмидной ДНК (0,1—1,0 мкг) и поместите на 5 мин в спиртовую баню с сухим льдом (—70 °С).
6. Инкубируйте на водяной бане при 37 °С в течение 25 мин.
7. Добавьте 2 мл среды YEB (или LBMG) и инкубируйте при 30 °С на качалке в течение 1 ч.
8. Высейте 100 мкл клеток на чашку со средой LBMG, содержащей ка-намицин или другой антибиотик, устойчивость к которому кодируется плазмидной ДНК, использовавшейся для трансформации; инкубируйте чашку при 30 °С в течение 1—2 суток.
9. Отберите отдельные колонии и рассейте их штрихами на той же селективной среде. Инкубируйте при 30 °С.
') Описание штамма A. iumefaciens LBA4404 см. в табл. 2.
2) На этом этапе клетки можно разделить на аликвоты по 200 мкл и длительное время хранить при —70 °С. Чтобы использовать их в работе, достаточно добавить ДНК и продолжить экспериментальную процедуру со стадии 6.
