Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2.3. Быстрое картирование коинтегратов челночного вектора и Ti-плазмидного акцепторного вектора в A. tumefaciens
Осуществив мобилизацию челночного вектора на основе pBR322 из Е. coli в A tumefaciens, необходимо удостовериться в том, что этот вектор интегрировался в рВИ322-содержащую область Т-ДНК Ti-плазмидного мутанта pGV3850. Электрофоретический анализ материала, обработанного рестрикционными эндонуклеазами, здесь малоэффективен, поскольку из-за большого размера Ti-плазмид (150—200 т.п.н.) образуется очень
Таблица 5. Конъюгативный перенос Ti-плазмид
1. Отберите одиночные колонии донорного штамма и реципиентного штамма бактерий и нарастите стационарные ночные культуры при 30 °С и слабом покачивании в 5 мл среды SM с добавлением FeS04 и MnS04.
2. Разведите культуры 1 :20 и инкубируйте в течение еще 6 ч, оптическая плотность при 600 нм (ОПбо'о) должна быть приблизительно равна
0,8 (2-109 клеток/мл).
3. Аккуратно смешайте равные порции донорных и реципиентных клеток и по 0,2 мл смеси профильтруйте через нитроцеллюлозные фильтры, как это описано в табл. 4. Поместите фильтры со средой SM, содержащей 1 мг/мл MnS04 и 2 г/л октопина или нопалина (в зависимости от потребности). Инкубируйте чашки в течение 2—4 дней при 30 °С.
4. Ресуспендируйте клетки с фильтров и высейте на селективные чашки, как описано в табл. 4*>. Селекцию по способности утилизировать опин проводят на среде SMNO (табл. 1).
5. Рассейте колонии эксконъюгантов штрихами, как описано в табл. 4.
>) Селекция эксконъюгантов упрощается, если переносимая Ti-плазмида содержит маркер лекарственной устойчивости. Например, pGV3850 иесет детерминанту устойчивости к карбенициллину.
334
Глава 4
большое количество фрагментов и их трудно идентифицировать. Хорошие результаты в этом случае дает блот-гибридизация по Саузерну. Препаративное выделение Ti-плазмидной ДНК — занятие дорогое и весьма трудоемкое, поэтому проще выделить суммарную ДНК A. tumefaciens из 10—20 разных колоний, руководствуясь методикой 6. Эта методика, разработанная Фар-финкелем и сотр. [20] для картирования Ti-плазмидных мутантов, возникших в результате инсерции транспозонов, обеспечивает получение 3—б мкг ДНК. ДНК можно обрабатывать подходящими рестрикционными эндонуклеазами (объем реакционной смеси 20 мкл, ДНК— 15 мкл). Следует также выделить ДНК из штамма A. tumefaciens GV3101, не содержащего Ti-плазмиду, и из штамма, имеющего родительскую плазмиду pGV3850. Кроме того, надо обработать рестриктазой ДНК pBR322:: X.
Проведя рестриктазную обработку образцов ДНК, смешайте
1 нг ДНК плазмиды pBR322 :: X с ДНК, выделенной из GV3101. Эта модель будет приблизительно отражать наиболее вероятную копийность плазмидной ДНК в анализируемых штаммах. Не забудьте о подходящем маркере молекулярной массы (например, ДНК фага К, обработанная Hindlll). Теперь препараты ДНК готовы для электрофоретического фракционирования в агарозном геле и последующего блот-гибридизационного анализа по Саузерну [16].
Альтернативным процедуре Саузерна методом является высушивание геля после окончания электрофореза. Его достоинством можно считать быстроту и дешевизну—можно не тратиться на нитроцеллюлозу или «Genescreen». ДНК в геле денатурируют и затем нейтрализуют точно так же, как в методике Саузерна. Потом гель помещают на два листа Whatman ЗММ, покрывают лавсановой или поливинилхлоридной пленкой («Sa-ranwrap») и высушивают на вакуумной сушилке без нагрева (в противном случае гель может оплавиться). Хорошие результаты дает облучение геля инфракрасной лампой для ускорения сушки. После того как гель высохнет, его осторожно отделяют от бумажной подложки, промывают в 3—5-SSC (1XSSC: 0,3 М NaCl; 0,03 М цитрат натрия), чтобы удалить оставшиеся бумажные волокна, и далее используют для пре-гибридизации и собственно гибридизации с зондом. Для описанной процедуры желательно при заливке геля применять тугоплавкую агарозу HGT (high gelling temperature): высушенный гель в этом случае отличается большей прочностью.
В качестве зонда используют ДНК челночного вектора, меченную in vitro путем ник-трансляции, и результаты гибридизации визуализируют с помощью радиоавтографии. Полученная картина распределения полос должна подтвердить факт интеграции челночной плазмиды в pGV3850. Штамм, обнаруживший
Генетическая инженерия растений
335
Таблица 6. Выделение ДНК из отдельных колоний A. tumefaciens для блот-гибридизационного анализа
1. Перенесите отдельную бактериальную колонию в 5 мл LBMG11 и инкубируйте при 30 °С на качалке в течение ночи до поздней логарифмической фазы.
2. Отберите по 1,5 мл в микроцентрифужные пробирки и осадите клетки центрифугированием в течение 5 мин.
3. Ресуспендируйте осадок клеток в 380 мкл ТЕ2), добавьте 20 мкл 25%-ного SDS, 100 мкл 5 мг/мл проназы (предварительно выдержанной при 27 °С в течение 2 ч) и инкубируйте при 37 °С в течение 30 мин.
4. Добавьте 50 мкл 5 М NaCl и инкубируйте при 68 °С в течение 30 мин.
