Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 143

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 137 138 139 140 141 142 < 143 > 144 145 146 147 148 149 .. 253 >> Следующая

Перенос Т-ДНК в геном растительной клетки связан с функционированием и некоторых других генетических локусов. Это,, например, протяженный (около 50 т. п. н.) участок, называемый областью vir, который содержит большое количество генов и в составе Ti-плазмиды картируется на достаточном удалении от Т-ДНК. Мутации любого гена, входящего в данный кластер, блокируют перенос Т-ДНК и, следовательно, лишают ее вирулентности. Недавно было показано, что некоторые из этих генов, не экспрессируются до тех пор, пока бактериальные клетки не приходят в контакт с растительной тканью; это с равным успехом может быть как непосредственный контакт клеток, так и контакт, опосредованный диализной мембраной [6]. Индуцирующий экспрессию этих бактериальных генов растительный фактор пока не идентифицирован. Ряд хромосомных мутаций: A. tumefaciens также лишает эту бактерию вирулентности. Предполагают, что соответствующие гены обеспечивают взаимодействие A. tumefaciens с растительной тканью в ходе инфекционного процесса.
Ti-плазмиды несут гены, обеспечивающие их конъюгативный перенос в невирулентные штаммы Agrobacterium. В норме эти гены не экспрессируются — их экспрессию запускает опин, продуцируемый в растительной ткани. Иными словами, опин действует как молекулярный «возбудитель», активирующий одновременно гены, участвующие в конъюгативном переносе генетического материала, и гены, обеспечивающие катаболизм опинов. Таким образом, Ti-плазмиды выработали весьма удачную стратегию эволюционного выживания. В инфицированной растительной ткани образующийся каллус пролиферирует и вырабатывает опины, которые Agrobacteria, несущие Ti-плазмиды,
•320
Глава 4
могут метаболизировать, используя в качестве источника углерода и азота; кроме того, эти бактерии приобретают способность передавать Ti-плазмиды другим невирулентным штаммам Agrobacteria, которые не содержат Ti-плазмид.
Высокая эффективность переноса Т-ДНК в растительные ткани при инфекции, а также способность Т-ДНК переносить ¦в своем составе чужеродные фрагменты ДНК делают Ti-плазмиды очень удобным вектором для введения ДНК в геном растительной клетки. Уже имеется опыт подобного переноса фрагментов чужеродной ДНК величиной до 50 т.п.н. [7]. Ограничения на размер вводимой ДНК пока не определены.
Основное неудобство в использовании Ti-плазмид связано с тем, что эти плазмиды вызывают у растений опухоли. Было бы желательно трансформировать растительные ткани чужеродной ДНК таким образом, чтобы это не сопровождалось развитием опухоли, так как из опухолевой ткани трудно регенерировать нормальное растение. С этой целью на основе Ti-плазмид были созданы векторы, имеющие делецию в области one (гены tmsl, tms2 и tmr), но сохраняющие граничные последовательности, обеспечивающие перенос Т-ДНК. Поскольку в этом случае инфицированная ткань сохраняет зависимость от фитогормонов, в состав векторов введены селективные маркеры — гены, обеспечивающие устойчивость растения к антибиотикам. Так, например, канамицин и метотрексат весьма токсичны для растений, и гены, детерминирующие устойчивость к этим агентам, оказались удобными доминантными селективными маркерами. Другие бактериальные антибиотики гораздо менее токсичны для растений и потому не могут использоваться в селекции. Гены лекарственной устойчивости бактериального происхождения не располагают специфическими чертами строения эукариотических генов, которые бы способствовали их успешной транскрипции в растительной ткани. Поэтому были сконструированы гибридные гены, которые содержат промоторы, функционирующие в растительных клетках; кодирующие зоны этих генов завершаются сигнальным блоком ААТААА, необходимым для полиаде-нилирования эукариотических транскриптов. Наиболее популярным промотором, используемым в подобных конструкциях, стал промотор Ti-плазмидного гена нопалин-синтазы. Этот ген обладает самой высокой транскрипционной активностью среди всех генов Т-ДНК и конститутивно экспрессируется в самых разных растениях. Описанные конструкции обеспечивают экспрессию в растениях фенотипа устойчивости к антибиотику и тем самым позволяют проводить селекцию трансформированной ткани.
Конструирование на базе Ti-плазмид векторов, содержащих селективные маркеры, стало основой исследовательских программ многих лабораторий в разных странах мира, поэтому не исключено, что многие векторы, обсуждаемые в данной главе,
Генетическая инженерия растений
321
в скором времени отойдут на второй план, уступив место новым улучшенным конструкциям.
Предлагаемые вниманию читателя векторные системы призваны проиллюстрировать все многообразие технологических приемов, разработанных для введения чужеродной ДНК в растения. Эти методы предполагают использование арсенала средств рекомбинантной технологии и проверку новых конструкций путем быстрой и эффективной трансформации ими клеток Е. coli. Проверенные конструкции затем можно вводить в A. tu-mefaciens с использованием конъюгации или трансформации, чтобы в конце концов ввести их в растительные клетки. Из-за большого размера Ti-плазмид непосредственно клонировать в них фрагменты чужеродной ДНК не представляется возможным. Для преодоления этой трудности предложено два альтернативных способа. Согласно одному из них, используется «разоруженная» (т. е. неонкогенная) Ti-плазмида, в составе которой находится копия pBR322, фланкированная граничными последовательностями Т-ДНК. Любая последовательность ДНК, клонированная в pBR322, может быть коинтегрирована в такую Ti-плазмиду (в область, расположенную между граничными последовательностями) благодаря гомологичной рекомбинации между последовательностями ДНК pBR322. При инфицировании растительных клеток вся ДНК, заключенная между граничными последовательностями, переносится в хромосомы этих клеток.
Предыдущая << 1 .. 137 138 139 140 141 142 < 143 > 144 145 146 147 148 149 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed