Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Если ставится задача ввести в какую-нибудь сельскохозяйственную культуру ген, обусловливающий новый, ценный в хозяйственном отношении признак, следует использовать челночный вектор, который обладает следующими свойствами.
1. Он должен содержать последовательность ДНК pBR322 или другой плазмиды из этого семейства, которая могла бы обеспечить коинтеграцию рекомбинантной конструкции в акцепторный вектор pGV3850 (см. выше).
2. Такой вектор должен иметь кодирующую область гена nptll, состыкованную с nos-промотором для того, чтобы стала возможной селекция трансформантов по устойчивости к кана-мицину. Однако при таком слиянии теряется последовательность Шайна-Далгарно, и образовавшаяся конструкция не экспрессируется в прокариотах.
3. Следовательно, вектору необходим альтернативный селективный маркер, который экспрессировался бы в бактериальных клетках и позволял проводить селекцию трансформантов Е. coli и в дальнейшем — селекцию коинтегратов в A. tumefaciens. Для этой цели подходит, например, ген Кпг из Tn903 (nptl)\ этот ген не обнаруживает заметной гомологии с nptll и, следовательно, не может провоцировать делецию плазмидной ДНК за счет гомологичной рекомбинации.
Векторная система, удовлетворяющая всем перечисленным требованиям, была недавно создана [14]. Эта плазмида, получившая обозначение pLVGneoll03, показана на рис. 3. Она содержит единичный iJcoRI-сайт для клонирования интересующего гена.
Исследователь может поставить перед собой и другую задачу— изучить некий индивидуальный растительный ген в плане регуляции его экспрессии и ее взаимосвязи с тканевой специфичностью, стадией развития растения, ее возможную светоза-висимость, реакцию на повреждение или инфекцию растения патогеном. Такой ген может быть выделен из растения, выращенного в специфических условиях, либо из специфической ткани путем клонирования кДНК, и его продукт может быть неизвестен. В этом случае целесообразно заменить кодирующую область данного гена на соответствующую область другого гена, для которого известен продукт и разработаны способы его идентификации. В качестве примера можно привести ген хлорамфе-
Генетическая инженерия растений
325
Smal/PvuII
MMpBR322 ШШПШШГеи NPTI (Тп903)
Ген NPTII (Тп 5) Промотор N0S
Рис. 3. Рестрикционная карта pLGVneoll03. Этот челночный вектор при коин-теграции в — pGV3850 обеспечивает селекцию канамицинустойчивых растительных трансформантов. (С любезного разрешения L. Herrera-Estrella.)
никол-ацетилтрансферазы (CAT) из бактериального транспозо-на Тп9. Пока еще активность CAT не может служить надежным селективным маркером при работе с растительными объектами, однако для работы с животными системами CAT-тест уже разработан и широко применяется (см. гл. б). Кодирующую область гена CAT можно выделить в виде SauШа-фрагмента из плазмиды pBR325. Измерение активности CAT дает возможность грубо оценивать транскрипционную активность растительного промотора. Делеционный мутагенез, направленный на 5'- и З'-концевые некодирующие зоны этой рекомбинантной конструкции, позволяет установить, какие домены в последовательности ДНК отвечают за модуляцию транскрипционной активности.
Конструирование рекомбинантных плазмид детально описано [15], и здесь мы не будем касаться этого вопроса. Лигированный материал используют для трансформации Е. coli (штамм НВ101) с последующей селекцией по устойчивости к соответ-
326
Глава 4
ствующему антибиотику. Проверку плазмидных конструкций осуществляют путем рестрикционного картирования ДНК, выделенной в аналитических количествах из ряда независимых трансформантов. Получив подтверждение, можно планировать эксперименты по коинтеграции полученной конструкции в pGV3850 в A. tumefaciens. Соответствующие процедуры описаны в разд. 2.2.
2.1.2. ОпС’-векторы
Векторная система pGV3850, описанная в предыдущем разделе,-относится к опс~-системам и, следовательно, более всего подходит для работ, связанных с изучением экспрессии чужеродных генов в интактных растениях, регенерированных из культур каллуса, или для генно-инженерных экспериментов, направленных на улучшение потребительских свойств сельскохозяйственных растений. Однако в определенных случаях представляет интерес исследование экспрессии чужеродных генов в корончатых галлах, и для этих целей необходимы опс+-векторы. Преимущество этих систем заключается в том, что в активно пролиферирующей ткани корончатых галлов трансформантов можно гораздо легче и быстрее обнаружить благодаря гормоннезависимому фенотипу (подробнее см. в разд. 3).
Рассмотрим два акцепторных опс+-вектора, аналогичных вектору pGV3850. Один из них — pGV3851 [16] имеет меньшую по размеру делецию внутри зоны Т-ДНК, чем pGV3850, левый внутренний участок Т-ДНК отсутствует и замещен последовательностью ДНК pBR322, а правый, включающий ген tmr, сохранен. Эта плазмида обусловливает появление фитогормонне-зависимых shooty-мутантов. Другой вектор — pMPGl [17]—содержит в нопалин-синтазном гене из pTiC58 космидную вставку рНС79 (гомологичную pBR322). Эта плазмида вызывает у .растений опухоли дикого типа пор-.
