Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
49. Shortle D., Hctber J. E., Botstein D. Science, 217, 371 (1982).
50. Scherer S., Davis R. W. Proc. Natl. Acad. Sci USA, 76, 3912 (1979).
51. Struhl K. Gene, 26, 231 (1983).
52. Siliciano P. G., Tatchell K. Cell, 37, 969 (1984).
53. Boeke J. D., Lacroute F., Fink G. R. Mol. Gen. Genet. (1984), in press.
54. Smith М. М., Murray K. J. Mol. Biol., 169, 641 (1983).
ГЛАВА 4
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ РАСТЕНИЙ
Конрад Лихтенштейн, Джон Дрейпер
1. Введение
Долгое время растения не использовались в качестве объекта молекулярно-биологических исследований. Это обусловлено, главным образом, их слабой генетической изученностью. И именно глубокое, полное знание генетики дрозофилы сделало плодовую мушку излюбленным объектом для молекулярных биологов. Значительные научные силы привлечены к работе на животных системах, поскольку такие исследования прямо связаны с проблемами рака и наследственных болезней человека. Это привело к появлению векторов для молекулярного клонирования на основе вирусов животных, которые позволяют трансформировать культивируемые клетки млекопитающих. Следует, однако, заметить, что по сравнению с животными растения (как объект) имеют одно важное преимущество, а именно — легкость, с которой недифференцированную растительную соматическую ткань можно заставить дифференцироваться in vitro и сформировать фертильное растение. Эта отличительная черта растений позволяет изучать экспрессию генов, заново введенных в целый организм. Кроме того, она дает в руки селекционеров новую технологию, которая предполагает генетическое улучшение важнейших сельскохозяйственных культур и, таким образом, дополняет классические методы селекции растений.
Итак, благодаря развитию в самое последнее время методов трансформации растений назревает (или уже назрела) новая молекулярно-генетическая «революция». В разд. 2 данной главы мы рассмотрим современные векторы, предназначенные для введения чужеродных клонированных генов в растения. Несмотря на то что было предложено большое разнообразие векторов на основе растительных вирусов, к настоящему времени ни один из них детально не разработан. Среди возможных кандидатов — векторы на базе содержащих одноцепочечную ДНК вирусов из группы Gemini, вирусов с двухцепочечной ДНК из группы Саи-limovirus (инфицирующих Brassicae) и вируса табачной мозаики с одноцепочечным РНК-геномом. Эти векторы характеризуются рядом недостатков — в частности, узкой хозяйской специфичностью, ограничениями на размер вставки и нестабильностью. Последнее замечание связано с тем, что упомянутые вирусы реплицируются автономно и не интегрируются в ядер-
316
Глава 4
ный геном растительных клеток. Указанные причины заставили нас сконцентрировать внимание на векторах, сконструированных на основе опухолеродных, так называемых Ti-плазмид (Ti — от англ. tumor inducing) Agrobacterium tumefaciens. Этот почвенный микроорганизм — поистине генный инженер: инфицируя растения, он вводит в их клетки фрагменты ДНК Ti-плазмид (Т-ДНК), которые интегрируются в ядерный геном и в дальнейшем экспрессируются. Векторы на основе Ti-плазмид выгодно отличаются широкой хозяйской специфичностью: они способны инфицировать большинство двудольных растений. Кроме того, для них, по-видимому, не характерны ограничения на размер чужеродной ДНК-
В разд. 3 мы коснемся вопросов, связанных с использованием векторов на базе Ti-плазмид, для трансформации растений. Здесь будут обсуждаться методы трансформации растительных тканей in planta и in vitro (трансформация протопластов). В качестве модельной системы мы выбрали трансформацию табака и других видов Nicotiana. Это связано с тем, что данные растения оказались наиболее удобными в плане работы с культурами тканей, в частности для получения жизнеспособных протопластов, из которых можно регенерировать целое растение. Недостаточное развитие методов культивирования тканей остается пока главным препятствием для проведения генно-инженерных работ с другими важными сельскохозяйственными культурами. Поскольку Ti-плазмидные векторы не могут использоваться для трансформации однодольных растений, мы включили альтернативные процедуры, которые позволяют вводить чужеродные гены в эти растения.
Раздел 4 посвящен современным методам выделения нуклеиновых кислот из растений. Эти процедуры необходимы при структурных и функциональных исследованиях чужеродных генов, введенных в растительную ткань, а также при конструировании геномных и кДНК-библиотек с целью клонирования и последующего изучения специфических генов растений. Эти гены часто идентифицируют, используя гетерологичные пробы, или в случае активных генов применяют методы, использующие высокую представленность соответствующих РНК в клетке. Поскольку многие из этих экспериментальных подходов хорошо известны и широко применяются в исследовательской практике, мы не будем их подробно касаться в данной главе. Исследованные к настоящему времени растительные гены включают представителей мультигенных семейств, кодирующих основные запасные белки, которые экспрессируются в семенах (например, ген зеина кукурузы), растительные транспозоны и индуцируемые светом гены, участвующие в фотосинтезе (о последних достижениях в этой области см. [1])-
