Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Другой недавно предложенный метод для осуществления множественных генных замещений базируется на достижениях генетики супрессорных мутаций дрожжей (Ким Назмит, личное сообщение). Штаммы, имеющие мутацию canl-100, устойчивы по отношению к канаванину — аналогу аргинина, обладающему цитотоксическим действием. Штаммы, которые несут аллель canl-100, но обладают эффективной ochre-cупрессией, чувствительны к канаванину, поскольку мутация canl-100 супрессиру-ется осйге-супрессорами.
Предложенный метод предполагает введение ochre-супрессора в интересующий ген с последующим замещением этим рекомбинантным фрагментом гена дикого типа; замещение производится на генетическом фоне canl-100, и в результате штамм становится чувствительным к канаванину (рис. 3,Б). Его транс-
Клонирование в дрожжах
311
CYH
+
SUP-o
URA3+
В —i-------------------h
I-
-К----h
cyh* I *4
О
или
I-----X------1 cyhR
H---------X---------I— I *H
can1°
+ I------X-----1
canl0
*--------h- I » I
ura 3~
ura3~
SYH
cyhR
CAN'
can"
URA+
5-FOAs
ura"
5-foaR
Рис. 3. Методы замещения гена. А. Сначала в устойчивом к циклогексимиду штамме (cyh2r) в последовательность интересующего гена внедряют фрагмент ДНК, содержащий ген дикого типа CYH2. Штамм становится чувствительным к циклогексимиду. Затем этот штамм трансформируют либо кольцевыми плазмидами, либо линейными молекулами (без плазмидной последовательности), содержащими желаемым образом измененный ген. Замещение интересующего гена, содержащего последовательность CYI12, на мутантную копию обусловливает реверсию штамма к циклогексимидустойчивому фенотипу. Б. В штамме, содержащем супрессируемый осАге-супрессором аллель канаваниновой устойчивости (сапГ), в последовательность интересующего гена внедряют фрагмент ДНК, несущий ochre-супрессор (SUP-o). Этот штамм трансформируют линейными молекулами, содержащими желаемым образом измененный ген. Акт замещения можно обнаружить по восстановлению канаваниновой устойчивости. В. В игеЗ~-штамме, в последовательность интересующего гена внедряют фрагмент, содержащий URA3+. При этом штамм становится чувствительным к
5-фтороротовой кислоте. Его трансформируют линейными молекулами, содержащими желаемым образом измененный ген. В результате замещения утрачивается фрагмент, содержащий URA3+, и восстанавливается устойчивость клеток к 5-фтороротовой кислоте.
формируют линейными фрагментами ДНК, которые содержат различные измененные формы интересующего гена. Поскольку утрата супрессорной активности может объясняться разными причинами, проводят котрансформацию штамма наряду с линейными молекулами кольцевыми автономно реплицирующимися молекулами, чтобы обогатить популяцию канаванинустойчи-вых клеток трансформантами. Отобранные канаванинустойчи-вые колонии тестируют затем на замещенный ген с помощью геномной блот-гибридизации или идентифицируют по фенотипу.
312
Глава 3
Использование котрансформадии оправдало себя и в тех случаях, когда не было возможности проводить селекцию генных замещений (Стратерн, Клар, личное сообщение; Руфолд, и Хинен, личное сообщение). Линейные фрагменты, содержащие-желаемым образом видоизмененный ген, вводили в клетки вместе с кольцевыми автономно реплицирующимися плазмидами, увеличивая тем самым количество трансформантов. Приблизительно 1% трансформантов содержал замещенный ген. Этот метод целесообразно применять тогда, когда замещение гена обусловливает появление характерного фенотипа. Для этого-исходный штамм должен нести генетически маркированное нарушение интересующего гена (например, инсерцию HIS3 в данный ген). Трансформантов в данном случае обнаруживают по-утрате исходной инсерции (в данном случае образуется генотип his3~), путем приготовления реплик на подходящей среде.
И наконец, еще один метод замещения гена, который мы рассмотрим в данной главе. Этот метод предусматривает использование 5-фтороротовой кислоты для селекции «замещенных» трансформантов. Дрожжи дикого типа чувствительны к 5-фтороротовой кислоте в концентрации 750 мкг/мл [53]. Устойчивые колонии формируются вследствие утраты функции URA3+ (помимо ряда других малопонятных причин). Устойчивость клеток ura3~ к 5-фтороротовой кислоте можно использовать в экспериментах по замещению генов (Ротстейн и др., неопубликованные наблюдения). В исходном штамме дрожжей-ura3~ интересующий ген нарушают, вводя в него с использованием одноэтапной процедуры фрагмент, содержащий ген ura3+-r получаются урацилнезависимые клетки (рис. 3,В). Затем эти клетки трансформируют линеаризованной ДНК, содержащей желаемым образом измененный in vitro ген, и проводят селекцию трансформантов на устойчивость к 5-фтороротовой кислоте. Замещение гена окончательно подтверждается с помощью геномной блот-гибридизации.
Итак, некоторые из описанных процедур замещения гена предполагают использование доминантных инсерций для нарушения интересующего нас гена; собственно замещение гена на изучаемый фрагмент сопровождается удалением инсерции и одновременной экспрессией рецессивного хромосомного аллеля. Следует, однако, заметить, что подобное изменение фенотипа клетки может обусловиться не только замещением гена. Так, среди устойчивых к 5-фтороротовой кислоте колоний мы обнаружили несколько клонов, возникших в результате генной конверсии при рекомбинации URA3+ с гомологичной хромосомной мутацией ura3~. Вдобавок мы обнаружили новые мутации ura3~ в инсерции URA3+. Такого рода события могут обусловливать заметный вклад в образование устойчивых колоний, если эффективность трансформации оказалась низкой. В этом плане
