Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
В заключительном разд. 5 мы обсудим различные методиче-
Генетическая инженерия растений
317
ские подходы, позволяющие изучать структуру и транскрипцию фрагментов чужеродной ДНК, интегрированных в растительные хромосомы. Здесь же будут представлены методики определения ферментов, которые кодируются генами, широко использующимися для трансформации растительных тканей.
2. Плазмидные векторы, позволяющие вводить чужеродные ДНК
в растения
Как уже говорилось в предыдущем разделе, в настоящее время известно много методов, позволяющих осуществлять перенос генетического материала в клетки растений. Пожалуй, наиболее удачным и в то же время самым простым методом следует считать использование природной системы переноса генов A. tumefaciens. Результаты последних исследований в этой области освещены в работах [1, 2].
A. tumefaciens — это почвенная бактерия, способная инфицировать широкий круг голосеменных и двудольных покрытосеменных растений. Подвергшаяся инфекции поврежденная ткань пролиферирует, давая начало опухолевому разрастанию, известному под названием «корончатый галл». Индуцированная опухоль способна продолжать рост и в отсутствие бактерии-возбудителя. Трансформированная растительная ткань растет в аксенической культуре, не требуя гормонов •— ауксинов и ци-токининов,— в норме необходимых культивируемым растительным клеткам. (До недавнего времени это свойство сохранять ростовую активность в отсутствие фитогормонов являлось единственным селективным маркером трансформированной ткани.) Кроме того, трансформированная растительная ткань синтезирует одно или несколько специфических соединений, которые не обнаруживаются в нетрансформированной ткани. Эти вещества называются опинами (например, октопин и нопалин); они могут специфически метаболизироваться бактериями — возбудителями опухоли. Все эти функции кодируются большими Ti-плаз-мидами A. tumefaciens, из которых наиболее хорошо изучены октопиновые и нопалиновые Ti-плазмиды. На рис. 1 приведены генетические карты этих плазмид. Специфический участок плазмидной ДНК, обозначенный как Т-ДНК, переносится в ядро-инфицируемой растительной клетки. Блот-гибридизационные эксперименты по Саузерну показали, что Т-ДНК интегрируется в ядерный геном. Аналогичные гибридизационные эксперименты с иммобилизованными на фильтре РНК (нозерн-блотинг) продемонстрировали, что интегрированная Т-ДНК транскрибируется: в случае октопиновых Ti-плазмид было идентифицирована восемь полиаденилированных транскриптов, которые в сумме представляли 0,001% тотальной полиаденилированной мРНК
318
Глава 4
Рис. 1. Генетическая карта октопиновой (слева) и нопалиновой (справа) Ti-плазмид. Показана область Т-ДНК; здесь картированы гены, направляющие синтез октопина и нопалина, а также гены, определяющие морфологию опухолей. Эти гены удалось идентифицировать при изучении rooty(tmr)- и shooty (tms)-мутантов. В плазмидах обоих типов участок слева от Т-ДНК определяет их вирулентность и способность индуцировать опухоли. За пределами Т-ДНК расположены также гены, ответственные за катаболизм октопина, нопалина и других опинов.
растительных клеток. Поскольку транскрипция Т-ДНК ингибируется а-аманитином, считается, что этот процесс осуществляет РНК-полимераза II. Анализ первичной последовательности Т-ДНК выявил открытые рамки считывания, коррелирующие с этими транскриптами; самим транскриптам предшествуют по-.следовательности ТАТА и в некоторых случаях СААТ, а заканчиваются они последовательностями ААТААА. Первые две из перечисленных последовательностей принято связывать с участками инициации транскрипции у большинства эукариот, а последовательность ААТААА, по предположению, служит сигна--лом полиаденилирования транскриптов. Картирование с помощью экзонуклеазы S1 подтвердило, что все эти последовательности расположены надлежащим образом относительно начала и конца транскриптов Т-ДНК. Генетический анализ с .использованием транспозониндуцируемых мутаций и делеций выявил в составе Т-ДНК четыре локуса, которые коррелируют с открытыми рамками считывания. Локус ocs кодирует фермент октопин-синтазу. Локус tmr кодирует фермент, участвующий в биосинтезе цитокинина [3]. Мутации по этому локусу проявляются в интенсивном разрастании корней из индуцированной опухоли (гоо/г/-мутанты). Локусы tmsl и tms2 кодируют ферменты, вовлеченные в биосинтез ауксина [4]. Мутации по любому из этих локусов вызывают пролиферацию побегов из опухоли (shooty-мутанты). .Эффекты, обусловленные изменением уровня ауксинов и цитокининов и наблюдаемые на опухолях, индуцированных мутантной Т-ДНК или Т-ДНК дикого типа, анало-
Генетическая инженерия растений
319-
гичны тем, которые имеют место при культивировании in vitro ^трансформированных тканей при различных концентрациях в среде ауксинов и цитокининов.
Механизм переноса Т-ДНК в геном клетки до конца не выяснен. Известно лишь, что Т-ДНК фланкирована почти полными повторами длиной 25 п. н. Предполагают, что именно эти последовательности ответственны за встраивание Т-ДНК в растительный геном, поскольку в интегрированной форме Т-ДНК ограничена участками, которые в составе плазмиды соседствуют с концевыми повторами. Удаление правой концевой зоны Т-ДНК путем делеционного мутагенеза Ti-плазмиды выключало перенос Т-ДНК в геном. В том же случае, когда в делетированный участок вводили синтетический олигонуклеотид, идентичный по последовательности концевому 25-нуклеотидному повтору Т-ДНК,, ее вирулентность и способность интегрироваться в геном восстанавливалась. Это наблюдалось только тогда, когда синтетическая последовательность была клонирована в той же ориентации, что и последовательность дикого типа [5].
