Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Как мы уже говорили, в данном случае заранее неизвестно, какая из дуплицированных копий представляет мутантный аллель. Однако разработано несколько методов, позволяющих обойти это препятствие. Согласно одному из них [46], небольшой фрагмент ДНК, прилежащий к интересующему гену, клонируют в составе интегрирующего вектора, который несет селективный дрожжевой маркер (например, YIp5). Интеграция гв гомологичную хромосомную область осуществляется за счет линеаризации плазмиды с разрывом внутри клонированной последовательности, как это описано в разд. 4.1. В результате
или
-*--------fr
I X I
Ч-X-h
Рис. 1. Методы спасения аллеля. А. Плазмида, содержащая копию интересующего гена, интегрируется в геном. В результате интегративной рекомбинации с гомологичной мутантной хромосомной последовательностью происходит дупликация данного гена, причем одна из копий оказывается мутантной, а другая— дикого типа. Поскольку интересующий мутантный фрагмент может располагаться с равной вероятностью с одной или с другой стороны плазмидной последовательности, геномную ДНК расщепляют независимо рестриктазами, узнающими сайты and. Формирующиеся в результате последующего лигирования плазмиды нарабатывают и выделяют, как описано в тексте. Б. Плазмида, содержащая субклонированный фрагмент, соседствующий в геноме с интересующей мутантной областью, интегрируется в геном. При этом интегрированная плазмида всегда локализуется с одной и той же стороны мутантного участка. Расщепление геномной ДНК рестриктазой, узнающей сайт d, позволяет в дальнейшем наработать и выделить плазмиду, несущую желаемую мутантную область (см. текст). Для этого плазмида должна иметь бактериальную область начала репликации и селективный маркер. В. Плазмиду, содержащую ars-последовэтельность и копию интересующего гена дикого типа, линеаризуют с помощью подходящих рестриктаз таким образом, чтобы удалить часть клонированной последовательности дикого типа (например, удаляют область между сайтами бис). Такой линеаризованной плазмидой трансформируют дрожжевые клетки, несущие мутацию в интересующем гене. Процесс репарации бреши в клонированной последовательности in vivo может привести: 1) к стабильной интеграции плазмиды в геном и к дупликации мутантного локуса (две мутантные копии гена разделены плазмидной последовательностью) и 2) к возникновению автономно реплицирующейся плазмиды, несущей мутантную копию гена. Эти плазмиды выделяют, как описано в тексте.
Клонирование в. дрожжах.
305
происшедшей гомологичной рекомбинации вектор встраивается рядом с интересующим нас аллелем (см. рис. 1,5). Трансформантов, содержащих плазмиду, идентифицируют с помощью гибридизации колоний, затем выделяют из них хромосомную ДНК и определяют топографию рекомбинантной области с помощью геномной блот-гибридизации. Для извлечения плазмиды хромосомную ДНК расщепляют подходящей рестриктазой (в данном случае специфичной к участку d, см. рис. 1,5). Такой фермент расщепляет вектор (недалеко от его края) «выше» интересующего гена, а прилежащую последовательность хромосомной ДНК — «ниже». Вырезание должно происходить таким образом, чтобы образовавшаяся в результате плазмида (нарабатываемая затем в Е. coli) содержала селективный маркер (например, ген устойчивости к ампициллину) и плазмидную область начала репликации.
Другой метод, также обеспечивающий выделение мутантного аллеля, использует феномен репарации бреши (рис. 1,5, [40]). Конструируют плазмиду, несущую селективный маркер и интересующую генетическую область дикого типа (целиком). Эту конструкцию обрабатывают подходящей рестриктазой (или ре-стриктазами), чтобы удалить часть последовательности гена-дикого типа (область b—с, см. рис. 1,5); в то же время по-краям плазмиды сохраняются области гомологии с соответствующими хромосомными районами. Линейные молекулы вводят в мутантный штамм и идентифицируют трансформантов, экспрессирующих селективный маркер. В процессе рекомбинации-происходит репарация бреши в плазмиде на матрице мутантной хромосомной последовательности. В результате в области интеграции мы обнаруживаем плазмидную последовательность,, фланкированную двумя идентичными мутантными копиями хромосомного аллеля. Векторную последовательность обнаруживают с помощью гибридизации колоний, а топографию рекомбинантной области определяют с помощью геномной блот-гибри-дизации. Извлечение плазмиды, содержащей как одну, так и-другую фланкирующую копию, дает в руки исследователя клонированный мутантный аллель интересующего гена.
Описанный выше метод с использованием репарации бреши можно модифицировать так, чтобы получить автономно реплицирующуюся плазмиду, которая содержала бы интересующий мутантный аллель (рис. 1,5, [40, 47]). Такую плазмиду можно-прямо выделять из препаратов суммарной дрожжевой ДНК путем трансформации компетентных клеток Е. coli — отпадает необходимость в рестриктазной обработке и последующем лигировании хромосомной дрожжевой ДНК. Этот метод предполагает наличие в плазмиде участков, ответственных за автономную-репликацию. Согласно приведенной схеме из линейной молекулы, содержащей селективный дрожжевой маркер и ars-no-
