Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
20-196
306
Глава 3
следовательностн, удаляют часть аллеля дикого типа, компле-ментирующую данную хромосомную мутацию. Отобранные трансформанты будут представлены двумя типами рекомбинантов, которые возникают с равной вероятностью после репарации бреши в зоне делеций. Один из них описан выше — это интегрированная плазмида, с двух сторон фланкированная копиями мутантного аллеля. Альтернативным вариантом будет автономно реплицирующаяся плазмида, содержащая мутантный аллель, который возник в результате репарации бреши на матрице хромосомного аллеля. Колонии, несущие автономно реплицирующиеся плазмиды, легко идентифицировать, если подрастить клетки в течение ночи на неселективной среде. В отличие от колоний, содержащих интегрированную плазмиду, эти клоны нестабильны в отношении селективного маркера. Далее из трансформантов выделяют суммарную дрожжевую ДНК, ею трансформируют клетки Е. coli и извлекают плазмиду, несущую интересующий аллель.
4.3. Методический прием «нарушение гена»
Иногда возникает задача нарушить ген, скажем, для изучения нулевого фенотипа или для того, чтобы на генетическом уровне показать, что именно клонированный фрагмент определяет данный конкретный фенотип. В последнем случае недостаточно продемонстрировать тесную генетическую связь между геном и плазмидой, встроившейся путем гомологичной рекомбинации в соответствующий хромосомный локус: всегда остается формальная возможность того, что вы клонировали супрессорную мутацию. Следовательно, возникает необходимость прямо продемонстрировать, что клонированный фрагмент кодирует данный фенотип. Это достигается путем искусственного ¦нарушения структуры гена в районе клонированного фрагмента: нарушенный аллель замещает интактный ген в соответствующем хромосомоном локусе, что в идеале сопровождается утратой дикого фенотипа. С целью практического решения этой задачи был разработан ряд методических подходов, известных как «трансплантация гена», «нарушение гена» и «замещение гена». Суть их одинакова и сводится к введению нефункциональной копии интересующего гена в соответствующий нормальный хромосомный локус.
Первым шагом в стратегии замещения гена является локализация всех генетических значимых районов в клонированном -фрагменте ДНК. Для этого строят транскрипционную карту или анализируют последовательность на предмет потенциально активных генов [8]. Эти области служат мишенями для различных манипуляций in vitro с клонированным фрагментом — в частности, для инсерционного или делеционного мутагенеза.
Клонирование в дрожжах.
ЗОГ
Затем, если фрагмент был идентифицирован по комплементации, мутировавший клон вводят в подходящее генетическое окружение и снова тестируют на комплементацию. Неспособность, комплементировать указывает на то, что интересующий нас ген нарушен. Существом направленного мутагенеза могут быть простые делеции рестрикционных фрагментов, случайные ин-серции линкеров [48] или рестрикционных фрагментов (последние могут иметь даже сравнимую, с геном величину) [25]. Следующий шаг — введение носителя мутации в геном.
Если предположительно определена локализация гена, в распоряжении экспериментатора имеется несколько способов его-, "¦ «разорвать» или нарушить. Один из методов предполагает субклонирование внутренней зоны гена в составе интегрирующего вектора, несущего селективный маркер [49]. Гомологичная рекомбинация между этим клонированным участком и хромосомным локусом приведет к нарушению гена — его физическому «разрыву» и отделению интактного 5'-конца от интактного З'-конца (рис. 2, А). Поскольку клонированный внутренний фрагмент не содержит интактных 5'- или З'-концов, оба дуплицированных участка, фланкирующие плазмиду, не способны обеспечить реконструкцию интактного гена. Преимуществом этого подхода является единственная стадия интеграции, а также сцепления генетического маркера, а именно селективного плазмидного гена, с нарушенным фенотипом. Подобное генетическое сцепление оказывается весьма полезным при генетических исследованиях, позволяя следить за фенотипом как в-отсутствие нарушения гена, так и при его наличии. Перечислим также ограничения метода.
1. Он дает возможность получить генетические дефекты только одного типа.
2. Многие гены не содержат таких рестрикционных фрагментов, наличие которых необходимо для проведения подобного-эксперимента.
3. Размер «нарушаемого» гена ограничен, так как фрагменты, имеющие в длину менее 250 пар оснований, неэффективно рекомбинируют с геномом.
4. Нарушения гена нестабильны: благодаря генетической
рекомбинации происходит разрушение дупликаций с частотой в некоторых случаях до 10^2.
Другая процедура нарушения гена предполагает трансплантацию мутировавшей в составе плазмиды последовательности в геном, т. е. замещение ею нормальной хромосомной копии [50]. Схематически этот подход изображен на рис. 2, Б. Сначала вводится мутация в клонированный интересующий ген, который находится в составе плазмиды, несущей селективный маркер (обычно URA3+). Затем осуществляется гомологичная рекомбинация этой плазмиды с аллелем дикого типа в геноме.
