Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
20*
308
Глава 3
(2)
-------------1------------h
±zr~f-
0
¦—к x—>'
Рис. 2. Методы нарушения гена. Л(1). Плазмида, содержащая внутренний фрагмент интересующего гена, интегрируется путем гомологичной рекомбинации в соответствующий локус хромосомы. А(2). В результате внедрения плазмиды последовательность гена оказывается разорванной. 5(1). Плазмида, содержащая желаемым образом измененный ген, интегрируется в гомологичную область хромосомы. 5(2). В результате интегративной рекомбинации происходит дупликация данного гена, причем одна из копий оказывается мутантной, а другая — дикого типа. 5(3). Проводят селекцию или скрининг на вы-щепление плазмиды. 5(4). В результате эксцизии у определенной части клеток в геноме остается мутантная копия гена. 5(1). В последовательность интересующего гена, клонированного в плазмиде, внедрен селективный маркер (зачерненный участок). Плазмиду расщепляют рестриктазами (узнающими сайты а и Ь) для того, чтобы удалить векторную последовательность. 5(2). Линейной ДНК трансформируют дрожжевые клетки и проводят селекцию на введенный маркер. 5 (3). В результате гомологичной рекомбинации происходит замещение хромосомного гена поврежденной копией.
Рекомбинационный кроссинговер может происходить с равной вероятностью по обе стороны от мутировавшего участка; в месте внедрения плазмиды возникает дупликация, причем одна из копий представляет мутантный ген, а другая — ген дикого типа. Следующий этап предполагает еще один акт рекомбинации, в результате которого плазмида выщепляется таким образом, что в геноме остается только мутантная копия гена. Успешное завершение этой процедуры требует, чтобы точка второго кроссинговера, который обеспечивает удаление вектора из ге-
Клонирование в дрожжах
309
нома, располагалась по другую сторону от мутантного участка относительно точки первого кроссинговера. В случае URA3+-co-держащих плазмид выщепление вектора облегчается благодаря селекции на среде с 5-фтороротовой кислотой (см. разд. 4.4). Рекомбинантов скринируют на отсутствие векторной последовательности с помощью гибридизации колоний, а на присутствие мутантного фрагмента — либо по соответствующему фенотипу, либо с помощью блот-гибридизации хромосомной ДНК. Основное достоинство описанного метода заключается в том, что он позволяет вводить в клонированный генный фрагмент практически любые изменения, лишь бы его гомология с геном дикого типа оставалась достаточной для того, чтобы обеспечить рекомбинацию и кроссинговер. Ограничения же налагаются главным образом двухстадийным процессом получения желаемой мутации. Наиболее трудными оказываются повторные генные замещения в интересующей области генома, поскольку каждое отдельное нарушение гена требует выполнения всей вышеописанной двухэтапной процедуры.
Третий способ замещения гена основывается на способности свободных концов ДНК стимулировать генетическую рекомбинацию [25]. Сначала в середину клонированной копии интересующего гена вводят селективный генетический маркер (рис. 2, В \ ). Затем удаляют всю или большую часть плазмидной векторной последовательности, получая в результате линейную молекулу, свободные концы которой могут спариваться с хромосомой. Вследствие происходящей здесь гомологичной рекомбинации хромосомная копия гена замещается на нарушенную in vitro копию. Нарушения, которые вводятся в ген с помощью данного метода, сводятся в основном к простым инсерциям, являющимся результатом клонирования селективного маркера в единичный рестрикционный сайт. Возможны также делеции, если селективный маркер замещает удаляемый из плазмиды рестрикционный фрагмент. Метод имеет следующие достоинства.
1. Для того чтобы нарушить хромосомный ген, требуется только осуществить трансформацию.
2. Нарушенный участок сцеплен с генетическим маркером.
3. Нарушение гена необратимо.
Ограничение метода связано с тем, что не всегда можно найти рестрикционный сайт, подходящий для простой инсерции.
4.4. Методы замещения гена
Одно из преимуществ молекулярной генетики дрожжей заключается в том, что исследователь имеет возможность изме-менять ген in vitro, вводить его точно в надлежащее место в геноме и анализировать генетические последствия такого измене-
310
Глава 3
ния. Разработан ряд методических приемов, которые позволяют независимо вводить в соответствующий хромосомный локус различные мутантные копии данного гена. Один из таких технологических принципов мы рассмотрели в предыдущем разделе [50]. Недавно разработан еще один подход, который предусматривает использование рецессивного маркера лекарственной устойчивости и соответствующего гена дикого типа, экспрессирующего «чувствительный» фенотип [51]. Сначала нужный штамм делают устойчивым к циклогексимиду по локусу cyh2 (ген, кодирующий рибосомный белок). Затем ген дикого типа,. CYH2, обусловливающий чувствительность к циклогексимиду, вводят в интересующий нас ген, который клонирован в плазмиде, несущей селективный маркер. Используя технику «трансплантации гена», копию интересующего гена, нарушенную внедрением CYH2, вводят в «устойчивый» геном, замещая ею копию дикого типа (см. рис. 3,А). В результате получается штамм, который чувствителен к циклогексимиду благодаря экспрессии фрагмента CYH2. В этот штамм вводят мутантную копию интересующего гена, трансформируя его кольцевой плазмидой или линейным фрагментом. Выдерживают необходимое для экспрессии фенотипа время и проводят селекцию рекомбинантов на среде, содержащей циклогексимид. Замещение нарушенной внедрением хромосомной области CYH2 его мутантной копией сопровождается утратой СУЯ2-ДНК, что запускает экспрессию рецессивного циклогексимидустойчивого фенотипа (гена cyh2T). Аналогичная стратегия с использованием канавани-новой устойчивости и соответствующего гена дикого типа также оказалась успешной в плане осуществления повторных замещений. Недостаток метода заключается в том, что все штаммы, содержащие измененные гены, экспрессируют их на циклогекси-мидустойчивом генетическом фоне. Этот фон может оказаться неблагоприятным для изучения интересующего гена (особенно в плане трансляционных исследований).
