Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
1. Нитроцеллюлозный фильтр кладут на лист бумаги Whatman ЗММ, пропитанный раствором «зимолиазы 60 000» (2 мг/мл) или «зимолиазы 100Т» (1 мг/мл) в 1 М сорбитоле — 20 мМ ЭДТА pH 7,4, после чего помещают в герметичный сосуд (обычно это неглубокая стеклянная емкость — например, чашка Петри,— закрытая пластиковой пленкой) и инкубируют при 37 °С в течение 4 ч или ночи, чтобы удалить клеточную стенку.
2. Контролируют процесс формирования сферопластов: при помощи зубочистки отбирают две равные порции дрожжевой биомассы, одну из них помещают в каплю 1 М сорбитола, а другую — в каплю 10% SDS и наблюдают под микроскопом, образуются ли «тени» клеток. Можно обойтись и без проверки, приняв на веру, что после ночной обработки клеточные стенки достаточно деградированы для того, чтобы не препятствовать эффективному лизису клеток.
3. Нитроцеллюлозный фильтр осторожно снимают с бумаги, переносят на другой лист Whatman ЗММ, пропитанный 0,1 М NaOH, и инкубируют при комнатной температуре в течение 7 мин.
300
Глава 3
4. Аккуратно переносят фильтр на следующую бумажную подложку, пропитанную 1 М трис-НС1 pH 7,4, и инкубируют при комнатной температуре в течение 4 мин. Затем повторяют эту процедуру.
5. Выдерживают фильтр 2 мин на листе Whatman ЗММ, пропитанном 2XSSC (lxSSC содержит 0,15 М NaCl и 0,015 М цитрата натрия).
6. Прогревают фильтр в вакуумной камере при 80 °С в течение 2 ч.
Обработанный таким образом фильтр готов для гибридизации. Далее его кладут на поверхность воды, чтобы он намок (надо сказать, что нитроцеллюлозный фильтр не всегда намокает равномерно в тех местах, где находятся зафиксированные колонии), после чего запаивают в прочный полиэтиленовый пакет с 10 мл буфера (5XSSC, 1%-ный саркозил). В одном пакете можно гибридизовать не более двух фильтров (при условии, что они накладываются один на другой); при этом их следует класть так, чтобы колонии находились снаружи «сэндвича». Пока длится пре-гибридизация (ее продолжительность может составлять от 15 мин до 24 ч), подготавливают меченый зонд: около 500 000 имп/мин меченной 32Р нуклеиновой кислоты денатурируют кипячением в 2,5 мл воды (в расчете на 1 фильтр). Непосредственно перед гибридизацией к пробе, находящейся на кипящей водяной бане, добавляют равный объем 10XSSC и 2% саркозила; удаляют из пакета с фильтром пре-гибриди-зационный раствор и заливают туда радиоактивную пробу. Тщательно удаляют воздушные пузыри и запаивают пакет. Гибридизация длится 12—18 ч при 65 °С. По истечении этого времени фильтр дважды промывают по 30 мин при 42 °С, мягко покачивая его в растворе 2XSSC — 0,5%-ный саркозил. Затем дважды промывают при 42°С в 2XSSC, высушивают на фильтровальной бумаге и экспонируют с ним рентгеновскую пленку. Если радиоактивный сигнал слаб, используют усиливающий экран [42]. Применяя описанную методику, можно обнаружить одиночную интегрированную копию плазмиды за 12—24 ч экспозиции, если, например, использовать в качестве меченого зонда ник-транслированную ДНК pBR322 с удельной радиоактивностью около 107 имп/мин/мкг [43].
3.5. Выделение дрожжевой ДНК и методы «спасения» плазмид
Выделение ДНК из дрожжей — обязательная процедура при конструировании библиотек клонов, а также при «спасении» или наработке плазмид — как интегрированных в геном, так и автономных. Очистка дрожжевой ДНК значительно упростилась со времени первых разработок Мармура и его коллег [44]. Относительно простой и быстрый метод получения дрожжевой
Клонирование в дрожжах
301
Таблица 6. Выделение дрожжевой ДНК
1. Нарастите 40 мл дрожжевой культуры в среде YPD до поздней логарифмической фазы (108 клеток/мл).
2. Осадите клетки путем центрифугирования на центрифуге Sorvall RC5 в роторе SA600 или SS34 (или эквивалентном в другой центрифуге) при 5000 об/мин в течение 5 мин. Промойте клетки, ресуспендировав осадок в ТЕ, и снова осадите их центрифугированием.
3. Ресуспендируйте осадок в 3,2 мл 1М сорбитола 0,1м ЭДТА; 14 мМ §-меркаптоэтанола; pH 7,4.
4. Чтобы удалить клеточную стенку, добавьте 0,1 мл раствора «зи-
молиазы 60 000» или «зимолиазы 100Т» (15 мг/мл) и инкубируйте при
37 °С в течение 5 мин. Если используется более разбавленный раствор зимолиазы (например, 2 мг/мл), увеличьте продолжительность инкубации.
5. Проверьте эффективность обработки визуально, отобрав две аликвоты по 50 мкл в 200 мкл 1 М сорбитола и в 200 мкл 10%-ного SDS. Переходите К следующим стадиям, если не менее 90% клеток превратилось в сферо-пласты.
6. Осадите сферопласты путем центрифугирования при 5000 об/мин в течение 5 мин, как описано в пункте 2.
7. Ресуспендируйте осадок в 3,2 мл ТЕ. Добавьте 0,3 мл 0,5 М ЭДТА и 0,3 мл 1 М трис-НС1 pH 7,4 и тщательно перемешайте. Добавьте 0,16 мл 10%-ного SDS.
8. Перемешайте суспензию круговыми движениями и поместите на 30 мин на 65°С.
9. Добавьте 1 мл 4 М ацетата калия и инкубируйте во льду в течение 1 ч.
10. Центрифугируйте при 15 000 об/мин в течение 25 мин, как описано в пункте 2. Аккуратно перенесите надосадочную жидкость в чистую пробирку.
