Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Клонирование в дрожжах
29!
что частота их спонтанной утраты не превышает 10-3 на одно поколение.
В заключение отметим, что выделить из клонотеки компле-ментирующий фрагмент—еще не значит получить клон, содержащий интересующий ген. Известно несколько примеров, когда комплементирующие фрагменты не соответствовали искомым генам [27]. Методы, позволяющие устанавливать соответствие между клонированными последовательностями ДНК и интересующими генами, обсуждаются в разд. 4.3.
3. Векторы для молекулярного клонирования в дрожжах и методы трансформации
Создание векторов для молекулярного клонирования в дрожжах и разработка соответствующих методик трансформации осуществлялись практически одновременно. В первых успешных экспериментах по трансформации дрожжей были использованы дрожжевые гены, клонированные с использованием комплементации в Е. coli [4, 6]. Затем стали использовать фрагменты эндогенных плазмид (2 мкм-кольцевых плазмид или 2 мкм-ко-лец), что позволило существенно повысить эффективность трансформации [7]. Были также обнаружены хромосомные последовательности, сообщающие вектору высокую трансформирующую способность [20]. Ниже мы приводим описание некоторых векторов и рекомендации по их использованию, а также методики трансформации дрожжей, поддержания и выращивания культур и селекции трансформатов. В табл. 1 включены некоторые наиболее широко используемые в трансформационных экспериментах штаммы дрожжей.
3.1. Векторы
Трансформация Saccharomyces cerevisiae предполагает два возможных пути развития событий — это интеграция и автономная репликация. Какой из этих путей реализуется, зависит от типа вектора и от того, в какой форме — интактной или линеаризованной— вводится ДНК (см разд. 4.1). У дрожжей интеграция плазмид осуществляется путем гомологичной рекомбинации. Плазмидные последовательности могут взаимодействовать с гомологичными участками на хромосоме двояким образом. Одна из возможностей — интеграция плазмиды в геном по участкам взаимной гомологии [6, 24]; другая — замещение участка хромосомной последовательности на плазмидную без интеграции вектора [6, 24]. Как то, так и другое событие наблюдается достаточно редко (приблизительно 1—10 трансфор-мантов/мкг ДНК/Ю7 клеток) при использовании кольцевых молекул, которые не способны к автономной репликации.
J9*
292
Глава 3
Высокой эффективности трансформации (103—104 трансфор-мантов/мкг ДНК/Ю7 клеток) можно добиться, если ввести в состав вектора определенные участки хромосом или 2мкм-колец [7, 20]. Эти последовательности позволяют вектору автономно реплицироваться и сообщают ему высокую трансформирующую способность. Подобные участки имеют обозначение ars (autonomously replicating segment) [20]. Плазмиды, содержащие ars-последовательности хромосомного происхождения, обычно нестабильны. Так, при культивировании дрожжей в неселективных условиях на протяжении 10 генераций плазмида сохраняется менее чем в 5% клеток. В то же время плазмиды, содержащие соответствующие участки 2мкм-колец, более стабильны: от 60 до 95% клеток после десяти генераций сохраняют плазмиду при культивировании в неселективных условиях [28]. В обоих случаях плазмиды представлены в клетках относительно большим числом копий (от 20 до 50 на клетку). Для плазмидных векторов, сконструированных на базе 2мкм-колец, минимальное количество 2мкм-ДНК, необходимое для обеспечения стабильности, включает область герЗ и обращенный повтор размером 599 п. н. Все остальные функции, кодируемые 2мкм-ДНК, могут обеспечиваться по гране-схеме другими эндогенными 2мкм-плазмидами [29].
Для повышения стабильности плазмидных векторов в них вводят добавочные последовательности. Например, при введении в состав плазмид, содержащих хромосомные ars-участки, центромерных последовательностей стабильность конструкций возрастает настолько, что через 10 генераций около 90% клеток сохраняют плазмиду [30]. Центромерные последовательности выступают также в роли модулятора количества копий плазмиды, сводя его к одной копии на клетку. Объединение в одной конструкции центромерных последовательностей и фрагментов 2мкм-плазмид обусловливает значительно более низкую стабильность, чем та, которая свойственна плазмидам, содержащим хромосомные ars-последовательности и участки центромер [28].
Недавно были сконструированы линейные плазмиды: теломерные зоны хромосом ресничных инфузорий или дрожжей ввели в состав плазмиды, чтобы получить автономно реплицирующуюся линейную молекулу [31]. Линейные плазмиды менее стабильны, чем кольцевые несущие центромерные последовательности: в 10-м поколении приблизительно 40% клеток содержит по 20—40 копий. Линейные молекулы можно дополнительно стабилизировать, если ввести в их состав дрожжевые центромерные последовательности и тем самым увеличить общий размер плазмиды [32]. Получившаяся в результате молекула по сути является минихромосомой, которая присутствует в клетке в единственном числе. Эта конструкция — наиболее стабильная из всех известных на сегодняшний день плазмид,
