Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
19. Schrempf H., Hopwood D. A., Goebel W. J. Bacteriol., 146, 360 (1975).
20. Lydiate D. Ph. D. Thesis, University of East Anglia, Norwich, UK, 1984.
21. Harris J. E., Chater K. F., Bruton C. J., Piret J. M. Gene, 22, 167 (1983).
22. Chater K. F., Bruion C. L, Springer WSuarez J. E. Gene, 15, 249 (1981).
23. Chater K. F., Bruton C. J. Gene (1984), in press.
24. Bibb М. I., Freeman R. F., Hopwood D. A. Mol. Gen Genet, 154, 155 (1977).
25. Chater K. F„ Hopwood D. A., Kieser Т., Thompson С. I. In: Gene Cloning in Organisms Other than E. coli, Hofschneider P. H. and Goebel W. (ed.). Springer Verlag, Berlin, 1982.
26. Ogawa H„ Imai S., Sat oh A., Kojima M. J. Antibiot., 36, 184 (1983).
27. Rodicio M. R„ Cater K. F. J. Bacteriol., 151, 1078 (1982).
28. Makins ]. F., Holt G. Nature, 293, 671 (1982).
29. Kieser T. Plasmid (1984), in press.
ГЛАВА 3
КЛОНИРОВАНИЕ В ДРОЖЖАХ
Родни Ротстейн
1. Введение
Данная глава адресована тем исследователям — а их число постоянно растет,— которые в качестве экспериментальной системы избрали дрожжи. Мы не планировали написать исчерпывающе полный обзор методов молекулярного клонирования & дрожжах — нашей целью было представить читателю лишь основные теоретические разработки и технические приемы, которые могут оказаться полезными при использовании дрожжей в генно-инженерных экспериментах. Все описанные методики применялись в работе с Saccharomyces cerevisiae. Многие экспериментальные процедуры были также успешно опробованы на дрожжах, не принадлежащих к роду Saccharomyces, и на некоторых нитчатых грибах. Первый раздел коротко касается методов идентификации клонированных дрожжевых генов. Следующий— посвящен конструированию векторов, трансформационным системам и общим методам отбора клонов. Заключительный раздел описывает технику манипулирования с клонированной ДНК дрожжей, включая методы направленной интеграции плазмид, «спасения аллеля», «нарушения гена» и повторных генных замещений.
2. Идентификация клонированных генов дрожжей
Для идентификации клонированных дрожжевых генов при-меняют различные методы. Первыми генами, выделенными из дрожжей, были гены структурных РНК — сначала рибосомной РНК [1J, а затем тРНК [2]. Для идентификации индуцибель-ных генов на дрожжах апробировали метод дифференциальной гибридизации [3]. Позднее гены стали идентифицировать по способности комплементировать соответствующие генетические дефекты в Е. coli [4, 5J. Применение охарактеризованных генов стимулировало разработку методов трансформации дрожжей [6, 7]. Введение этих методов в широкую исследовательскую практику позволило клонировать в дрожжах большое количество генов, используя феномен генетической комплементации; основой полученных генных банков служат векторы для молекулярного клонирования, описанные в разделе 3.1. Ниже мы коснемся некоторых методов идентификации клонированных генов дрожжей.
286
Глава 3
2.1. Клонирование генов структурных РНК и мРНК
Одним из наиболее простых и вместе с тем самым прямым методическим подходом к клонированию генов является использование в качестве зонда очищенной РНК. В случае структурных РНК, таких, как рРНК, тРНК и яРНК, получить высококачественный зонд относительно нетрудно. Эту РНК радиоактивно метят (либо 32Р с помощью полинуклеотидкиназы, либо 1251 — химическими методами) и затем используют для скрининга плазмидной или фаговой библиотеки [8]. Такой подход можно применить и в том случае, когда в качестве меченой пробы (зонда) выступает мРНК.
Отдельные популяции молекул мРНК, а также некоторые индивидуальные классы информационных транскриптов удается получать в чистом виде, используя различные методы обогащения, например фракционирование полисом.
2.2. Клонирование с использованием дифференциальной гибридизации
Скрининг клонов путем дифференциальной гибридизации впервые был осуществлен на дрожжевом банке при отборе генов, индуцируемых галактозой [3]. Геномную библиотеку дрожжей в ^-векторе высеяли на чашки при плотности 500 бляшек на чашку. Через 24 ч с каждой чашки были сделаны двойные реплики на нитроцеллюлозные фильтры, которые затем гибри-дизовали с радиоактивно меченными РНК- или кДНК-зондами, выделенными из клеток, находившихся в двух различных контрольных состояниях. Так, галактозные гены были отобраны на основании позитивного сигнала, полученного лишь в одной из параллелей, а именно при гибридизации с РНК-зондом, выделенным из клеток, индуцированных галактозой.
2.3. Клонирование с использованием методов гибридизационной селекции и скрининга антителами
Гены, белковые продукты которых уже охарактеризованы, можно идентифицировать с помощью метода гибридизационной селекции [9]. Метод основан на специфическом удалении из препарата тотальной мРНК тех информационных транскриптов, которые кодируют белковый продукт данного гена за счет гиб-ридизационного связывания их с клонированной ДНК.
