Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
После трансформации протопласты стрептомицетов регенерируют довольно долго, поэтому перед тем, как приступать к. получению банка, стоит проверить полноту дефосфорилирова-ния вектора и одновременно его способность лигироваться. Обычно проверяют только первый из указанных параметров, используя в качестве критерия оценки неспособность вектора лигироваться по типу «сам на себя». Однако неэффективность лигирования в этом случае может объясняться также повреждением «липких» концов вектора или присутствием в препарате ингибитора лигазы (например, фенола). Поэтому здесь необходим дополнительный позитивный контроль, показывающий, что дефосфорилированный вектор сохранил способность лигироваться со вставкой. Роль вставки в таком проверочном эксперименте может выполнить другая плазмида. Рис. 7 демонстрирует результаты подобного теста. Плазмиду размером 12 т.п.н., обработанную Bglll, лигировали со вставкой — плазмидой pUC19, разрезанной BamHI (2,7 т.п.н.). Вначале необходимо удостовериться, что разрезанный вектор до обработки фосфа-тазой может лигироваться «сам на себя» (дорожка 2), т. е. рестрикционный фермент оставляет интактные липкие концы, способные ковалентно воссоединяться в реакции лигирования. После фосфатазной обработки вектор теряет способность ковалентно замыкаться сам на себя (дорожка 4). Однако после добавления «ДНК-вставки» (дорожка 5) и затем лигазы (дорожка 6) происходит эффективное лигирование компонентов —
274 Глава 2
1 2 3 4 5 G 7 8
Рис. 7. Проверка эффективности фосфатазной обработки вектора. Дорожка 1—ДНК фага X, обработанная ЯшсПП; 2 — векторная ДНК (12 т.п.н.), лигированная без предварительной обработки фосфатазой; 3 — векторная ДНК, обработанная фосфатазой; 4 — векторная ДНК, лигированная после фосфатазной обработки; 5 — обработанная фосфатазой векторная ДНК+встав-ка (2,7 т.п.н.) до лигирования; 6 — обработанная фосфатазой векторная ДНК.+вставка после лигирования; 7 — ДНК-вставка до лигирования; 8 — ДНК-вставка после лигирования «на себя».
это можно проследить по исчезновению полосы, соответствующей ДНК вектора в дорожке 6 (сравните с дорожкой 5). Контролем служит также поведение собственно ДНК-вставки (дорожка 7) в реакции лигирования (дорожка 8). Если в дорожке 8 мы наблюдаем нормальную картину лигирования, а в дорожке 6 — нет, это означает, что препарат вектора содержит ингибитор лигазы. Если же в дорожке 6 вставка залигирова-лась нормально, а вектор — нет (полоса векторной ДНК видна так же хорошо, как в дорожке 5), скорее всего, повреждены его липкие концы. В этом случае лучше всего приготовить новый вектор.
4.3. Лигирование ДНК
Для создания генной библиотеки ДНК лигируют при общей концентрации 20 мкг/мл; молярное соотношение вставка — вектор составляет обычно 2:1. Реакционная смесь содержит 66 мМ трис-НС1 (pH 7,6); 6 мМ MgCl2; Ю мМ ДТТ и 1 мМ АТР. Раствор АТР при приготовлении следует нейтрализовать NaOH
Клонирование генов в стрептомицетах
276
до pH 7,6. Нагрейте лигазную смесь до 65 °С, выдержите при этой температуре 10 мин и охладите на льду, перед тем как добавлять лигазу. Эта процедура необходима для того, чтобы разрушить внутримолекулярные водородные связи, которые образовались в процессе приготовления препарата благодаря наличию липких концов. Инкубируйте смесь при 14 °С в течение ночи, затем осадите ДНК этанолом и для трансформации растворите в буфере ТЕ. К примеру, имея 5,5 мкг ДНК piJ702 (5,6 т.п.н.) и вставки со средним размером 7,5 т.п.н., мы достигнем двукратного молярного избытка вставочной ДНК, взяв ее в количестве
2- 5,5 (7,5/5,6) = 14,7 мкг.
При этом общее количество ДНК в реакции лигирования будет равно 20,2 мкг. Следовательно, объем реакционной смеси должен составлять 1,01 мл.
4.4. Получение протопластов
Описание процедуры приведено в табл. 7. Клетки выращивают в присутствии глицина, который делает мицелий более восприимчивым к действию лизоцима. (Отметим, что глицин также замедляет рост мицелия.) Протопласты можно получать
Таблица 7. Получение протопластов стрептомицетов
1. Внесите в 25 мл среды TSB или YEME (в зависимости от штамма см. текст) 0,1 мл суспензии спор. Добавьте MgCb и глицин до конечной концентрации 5 мМ и 0,5% соответственно. Инкубируйте на качалке при 30 °С в течение 2 сут.
2. Соберите мицелий центрифугированием в роторе Beckman JA20 (или эквивалентном) при 5000 об/мин (3000 g), 20°С в течение 10 мин. Ресуспен-дируйте осадок в 10 мл 0,3 М сахарозы, чтобы промыть клетки, и снова центрифугируйте при 5000 об/мин в течение 10 мин.
3. Ресуспендируйте 0,3—1,0 г осажденных клеток в 4 мл свежеприготовленного раствора лизоцима1' (1 мг/мл). Инкубируйте в течение 30 мин при 37 °С. Поддерживайте мицелий во взвешенном состоянии, постоянно помешивая суспензию стеклянной палочкой.
4. Добавьте 5 мл среды Р2> и профильтруйте суспензию через несорбирующую хлопковую вату (рис. 5). Центрифугируйте 10 мин при 5000 об/мин.
