Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 131

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 125 126 127 128 129 130 < 131 > 132 133 134 135 136 137 .. 253 >> Следующая

Клонирование в дрожжах
293
полученных in vitro, но в то же время она на два порядка уступает по этому параметру природным хромосомам.
И наконец, разработаны векторы, позволяющие осуществлять экспрессию клонированных генов и секрецию их белковых продуктов в дрожжевых клетках. Некоторые из экспрессирующих векторов имеют в своем составе сильные конститутивные промоторы — такие, например, как промотор алкогольдегидро-геназы [33], тогда как в других используются регулируемые промоторы таких генов, как ген 1ЮР-галактоза-4-эпимеразы [29] или кислой фосфатазы [34]. При создании экспрессирующих векторных систем, обеспечивающих секрецию белковых продуктов, был использован участок гена, кодирующий сигнальный пептид полового феромона дрожжей — а-фактора [35].
В табл. 2 приведены примеры различных типов векторов, описанных выше. Для некоторых из них приведены ссылки на литературный источник, а также описаны свойства и потенциальные возможности.
3.2. Методы трансформации дрожжей
Первые два метода трансформации, разработанные для дрожжей, предусматривали удаление клеточной стенки с по-'мощью ^-глюканазы, обработку сферопластов ионами Са2+, внесение в суспензию сферопластов ДНК и наконец обработку полиэтиленгликолем (PEG 4000) [6, 7]. Затем трансформированные клетки промывали и погружали в осмотически стабилизированный регенерационный агар. На этих первоначальных разработках основывается методика, представленная в табл. 3. Эффективность трансформации сферопластов при использовании ДНК автономно реплицирующихся плазмид варьировала от 102 до 105 трансформантов/мкг/107 клеток в зависимости от штамма. Существенным моментом в этой процедуре является осторожное обращение со сферопластами, начиная с самых первых этапов их приготовления; клетки нельзя встряхивать на вибромиксере.
Недавно описана процедура трансформации, которая не требует удаления клеточной стенки и регенерации сферопластов. Согласно этому методу (см. методику 4), интактные клетки обрабатывают солями лития, смешивают с ДНК и затем добавляют PEG 4000 [38]. Селекцию трансформантов можно проводить, прямо высевая клетки на соответствующую агаризованную среду. Основной недостаток этого метода заключается в том, что для многих штаммов число трансформантов, получаемых при использовании автономно реплицирующихся плазмид, оказывается в 10—100 раз ниже, чем при трансформации сферопластов. В то же время эффективность трансформации «литиевых» клеток линейными плазмидами весьма высока (см.
Таблица 2. Векторы для молекулярного клонирования в дрожжах
Тип вектора
Пример
(ссылка)
Описание
Свойства
Интегрирующийся Y1 р5 [23] Вектор на основе Эта плазмида «неохот-
pBR322, содержит но» рекомбинирует с селективный мар- некоторыми хромосом-кер игаЗ+ ными аллелями игаЗ
(например, игаЗ-52 или игаЗ-50), поэтому дрожжевые последовательности, клонированные в этом векторе, в основном рекомбинируют с гомологичными им участками хромосом
Векторы на основе Эти векторы трансфор-pBR322 и рМВ9 мируют дрожжевые соответственно; клетки с высокой эф-содержат селек- фективностью и реп-тивный дрожже- лицируются автономно, вой маркер LEU2+ Обычно их используют и участки авто- для создания библиотек номной реплика- генов, скринируемых по ции 2-мкм колец комплементации. Присутствие нативных 2-мкм плазмид в хозяйских клетках повышает стабильность этих векторов
Векторы на осно- Эти векторы трансфор-ве pBR322; содер- мируют дрожжевые жат ген TRP1+ и клетки с высокой эф-прилежащие хро- фективностью и репли-мосомные ars-no- цируются автономно, следов а тельности Трансформанты относительно нестабильны: в неселективных условиях в 10-м поколении около 90% клеток утрачивает плазмиду. Обычно векторы присутствуют в клетке во многих копиях. YRp7 был использован для клонирования генов дрожжей с использованием комплементации.
Автономный высо- YLpl [31,32] Линейная плаз- Высококопийный вектор кокопийный-тело- мида с твломер- с относительно низкой
мерный ными участками стабильностью: в несе-
из рДНК. макро- лективных условиях нуклеуса тетрахи- только 10% клеток в мены; содержит 10-м поколении сохраня-дрожжевой селек- ет плазмиду. Использу-тивный маркер ется для клонирования LEU2+ в составе теломерных последова-pBR322 тельностей дрожжей и
конструирования минихромосом
Автономный вы- YRp7 [23] сококопийный-хро- YRpl7 мосомный (эквивалент
YRp7 с уникальным сайтом .EcoRI)
Автономный вы- YEpl3 [36] сококопийный— pJDB219 [7] 2 мкм
Продолжение
Тип вектора
Пример
(ссылка)
Описание
Свойства
Автономный низ- YCpl9 [37]
кокопийный-цент-
ромерный
Кольцевая плаз- Низкокопийный вектор; мида на основе относительно стабилен pBR.322; содержит в неселективных услови-два селективных ях: в 10-м поколении
Предыдущая << 1 .. 125 126 127 128 129 130 < 131 > 132 133 134 135 136 137 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed