Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
3. Добавьте ДНК в объеме, не превышающем 10 мкл. Оставьте на 10 с во льду.
4. Добавьте 0,5 мл 25%-ного раствора PEG 1500 и несколько раз пипе-тируйте, чтобы перемешать смесь. Оставьте на 1 мин во льду.
5. Добавьте 2 мл среды Р [5] и пипетируйте до полного перемешивания суспензии. Вылейте раствор на регенерационную среду. Если необходимо, предварительно сделайте разведения суспензии средой Р.
') «T-смесь» и другие среды описаны в разд. 5.
278
Глава 2
ное влияние на эффективность трансформации протопластов. Наш опыт свидетельствует о стабильности и хорошем качестве препаратов полиэтиленгликоля фирмы BDH.
Мы никогда не добавляли более 1 мкг ДНК к 100 мкл порции протопластов. Если для создания банка генов необходимы большие количества ДНК, размораживаются несколько фасовок протопластов и смешиваются. В этом случае количественные параметры процедуры трансформации (табл. 7) пропорционально увеличиваются. Например, для 5 мкг ДНК мы берем 5 фасовок протопластов; 2,5 мл 25%-ного раствора PEG и 10 мл среды Р.
После разбавления трансформационной смеси средой Р на стадии 5 концентрация PEG составляет 4—5%, что вполне приемлемо для высева протопластов. Если содержание PEG в среде слишком велико, смесь остается очень вязкой и распределяется на регенерационных чашках неравномерно. Если необходимо, можно удалить PEG путем центрифугирования трансформационной смеси при 3000g в течение 10 мин и затем аккуратно ре-суспендировать осадок в свежей среде Р. В приведенном выше примере для 5 мкг ДНК объем суспензии трансформированных протопластов будет составлять 13 мл, что потребует для высева 130 чашек! Центрифугирование смеси и последующее суспендирование осадка в малом объеме среды Р позволяют обойтись гораздо меньшим числом чашек.
Для некоторых штаммов понижение содержания ионов Са2+ в трансформационной смеси («Т-смесь») со 100 мМ до 10 мМ в 5—10 раз повышает эффективность трансформации.
Ранее сообщалось [271 о том, что включение плазмидной ДНК в липосомы [28] повышает ее способность трансформировать протопласты. Однако в нашей лаборатории воспроизвести эти результаты не удалось. Добавление пустых липосом к ДНК перед трансформацией протопластов не влияло на эффективность этой процедуры. В то же время было показано, что пустые липосомы действительно стимулируют трансформацию фаговой ДНК. Как бы то ни было, для большинства плаз-мидных векторов эффективность трансформации сейчас достаточно высока, и технологические сложности, связанные с получением липосом, становятся препятствием для их применения в плазмидной трансформации.
4.6. Регенерация
Протопласты стрептомицетов регенерируют на твердой среде. Пока еще не разработан метод регенерации клеточных стенок у протопластов в жидкой культуре.
Регенерационная среда для протопластов стрептомицетов (R2) изначально предназначалась для экспериментов по слия-
Клонирование генов в стрептомицетах
279
нию протопластов. Источником углерода в этой среде является глюкоза; среда R2 богата азотом, содержит большие количества ионов Mg2+ и Са2+ и характеризуется высокой концентрацией сахарозы, которая выполняет роль осмотически активного компонента (см. разд. 5). Несовместимость некоторых ингредиентов в режиме автоклавирования диктует необходимость приготавливать среду в виде двух растворов, стерилизовать их по отдельности и объединять лишь перед употреблением, одновременно добавляя фосфат. Температура агара перед разливкой должна быть 50 °С. Чтобы создать оптимальные условия для регенерации протопластов, свежезалитые чашки рекомендуется немного подсушить. Объяснить феномен более эффективной регенерации протопластов на подсушенных чашках еще предстоит, однако его реальность несомненна. Например, для 5. lividans наилучшие результаты дает 5—10%-ная (по весу) усушка чашек. Этого можно достигнуть, либо оставив на определенное время свежезалитые чашки открытыми в ламинарном боксе, либо заливая чашки за 1—2 дня до использования (в зависимости от влажности атмосферного воздуха) и сохраняя их на лабораторном столе. В первом случае односторонний ток воздуха над чашками может вызвать неравномерное их подсыхание, что приведет к тому, что протопласты будут регенерировать на одной стороне чашки быстрее, чем на другой. Поэтому мы предпочитаем второй метод, однако он требует четкого планирования эксперимента. Оптимальная степень подсушивания чашек варьирует в зависимости от штамма.
4.6.1, Регенерация неохарактеризованных штаммов
Не исключено, что в случае неохарактеризованного штамма для достижения оптимального результата понадобится изменить состав регенерационного агара. Попробуйте выполнить следующие рекомендации в порядке их перечисления.
1. Источник углерода. Удостоверьтесь, что глюкоза — подходящий источник углерода для данного штамма.
2. Содержание сахарозы. R2 содержит 0,3 М сахарозу. Некоторые штаммы, например S. rimosus, лучше всего регенерируют на среде, содержащей 0,6 М сахарозу. Испробуйте интервал концентраций сахарозы от 0,2 до 0,8 М. Применение в качестве осмотически активного компонента других веществ, таких, как КС1, сорбитол и т. д., не дает положительного эффекта.
