Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
5. Мягко ресуспендируйте осадок в 5 Мл среды Р и повторите центрифугирование.
6. Повторите этап 5.
7. Мягко ресуспендируйте осадок в 2 мл среды Р. Расфасуйте суспензию порциями по 100 мкл и заморозьте при •—20 °С. Хорошие препараты дают 5-107 протопластов.
!) В раствор лизоцима можно также добавить ахромопептидазу в концентрации
1 мг/мл; подробности см. в тексте.
2) Состав сред приведен в разд. 5.
18*
I
276 Глава 2
из большинства штаммов, нарастив их до относительно высокой плотности, — т. е. на стадии позднего логарифмического роста. Однако некоторые штаммы обнаруживают более высокую эффективность трансформации, если протопласты были получены на ранней и средней фазах логарифмического роста культуры. 0,5% концентрации глицина в среде культивирования, по-видимому, является оптимальной для большинства штаммов. При меньшем содержании глицина в среде мицелий остается относительно устойчивым к действию лизоцима, а большие количества существенно замедляют рост клеток.
Центрифугировать мицелий следует осторожно, на низких скоростях, поскольку мицелиальный осадок, полученный при больших центробежных ускорениях (более 10 000 g), довольно трудно ресуспендировать до гомогенного состояния. Образующиеся при этом сгустки снижают выход протопластов.
Во время инкубации с лизоцимом формирование протопластов можно наблюдать под микроскопом, используя объектив Х40. Под фазово-контрастным микроскопом протопласты имеют вид маленьких сфер, которые лизируются при добавлении к препарату капли воды. Мицелии намного крупнее несферической формы и, естественно, не лизируются. Длительная инкубация с лизоцимом снижает эффективность трансформации полученных протопластов. В случае неохарактеризованных штаммов целесообразно через определенные промежутки времени инкубации отбирать пробы, оценивать под микроскопом количество протопластов и проверять эффективность Их трансформации. Анализируя состояние препарата под микроскопом, исследователь довольно скоро вырабатывает в себе «шестое чувство», подсказывающее ему оптимальное время окончания инкубации с лизоцимом. Некоторые штаммы «склонны» очень быстро образовывать сгустки протопластов. Чтобы этого избежать, следует снизить концентрацию лизоцима до 0,2—
0,3 мг/мл.
Некоторые штаммы формируют протопласты с трудом. В этих случаях может помочь добавление ахромопептидазы, облегчающей этот процесс [26]. Ахромопептидазу обычно добавляют в раствор лизоцима в той же концентрации—1 мг/мл. Варьирование соотношения лизоцима и ахромопептидазы не дает ощутимого эффекта.
Протопласты Streptomyces хорошо хранятся при •—20 °С. После годичного хранения не обнаруживается заметного снижения их трансформационной компетентности. Повторные циклы замораживания-оттаивания существенно увеличивают время регенерации протопластов, поэтому лучше их избегать. Кроме того, в этой ситуации трудно определить момент для наслаивания антибиотиков (см. раздел 4.7). Рекомендуется замораживать протопласты небольшими порциями и размораживать
\
-V
Клонирование генов в стрептомицетах
277
каждую порцию целиком, один раз — непосредственно перед трансформацией. Аликвота объемом 100 мкл может дать 5-107 регенерировавших протопластов.
4.4.1. Анализ причин низкого выхода протопластов при работе с неохарактеризованным штаммом
1. Проверьте стеклянную посуду — не осталось ли на ней следовых количеств детергентов, к которым протопласты очень чувствительны. Если есть подозрение на стекло, работайте с пластиковыми пробирками или промойте стеклянную посуду азотной кислотой.
2. Варьируйте время культивирования до осаждения мицелия.
3. Варьируйте время инкубации с лизоцимом и его концентрацию, контролируя процесс формирования протопластов под микроскопом.
4. Используйте раствор лизоцима, содержащий ахромопеп-тидазу.
4.5. Трансформация
ДНК вводится в протопласты в присутствии PEG (табл. 8). Средняя мол. масса PEG, по-видимому, не влияет на эффективность трансформации. В нашей лаборатории чаще всего используют PEG 1500 (BDH), хотя PEG6000 работает также хорошо. Мы уже упоминали, что коммерческие препараты разных фирм-производителей и даже разные партии одной и той же фирмы обычно содержат следовые количества посторонних веществ, которые могут оказывать как положительное, так и отрицатель-
Таблица 8. Трансформация протопластов стрептомицетов
1. Приготовьте свежий 25%-ный раствор полиэтиленгликоля (PEG 1500) в «Т-смеси»4> [5]. Удобно приготовить навески по 1 г PEG 1500 в стеклянных флакончиках и после автоклавирования (121°С, 10 мин) хранить их при комнатной температуре. По мере надобности флаконы нагревают до 65 °С, чтобы расплавить PEG, и добавляют в каждый по 3 мл стерильной «Т-сме-си» — получается 25%-ный раствор.
2. Замороженным протопластам (методика в табл. 7) дайте оттаять на льду. Мягко перемешайте суспензию наконечником микропипетки, чтобы она стала гомогенной.
