Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
8. Для центрифугирования в роторе Beckman VTi50 доведите объем раствора до 38 мл, добавив подходящий раствор CsCl1*, и заполните центрифужную пробирку. Закройте пробирку, руководствуясь инструкцией.
9. Проведите равновесное центрифугирование. Для ротора VTi рекомендуемый режим 15 ч при 45 000 об/мин, 20 °С.
10. Отберите нижнюю полосу, соответствующую плазмидной ДНК, с помощью шприца и широкой иглы. Стадии 11 и 12 не являются обязательными и включаются в методику только в том случае, если плазмида загрязнена хромосомной ДНК. Если же загрязнения нет, переходите к этапу 13.
11. Перенесите отобранную плазмидную фракцию в пробирку для ротора Beckman VTi65. Заполните пробирку доверху раствором CsCl1'. Центрифугируйте до достижения равновесия (55 000 об/мин, 4 ч, 20 °С).
12. Визуализируйте ДНК путем облучения длинноволновым УФ светом. Отберите полосу, соответствующую плазмидной ДНК, с помощью шприца и широкой иглы, проколов боковую стенку пробирки.
13. Удалите из раствора плазмидной ДНК этидиумбромид, экстрагируя его водонасыщенным бутанолом. Повторяйте экстракцию до тех пор, пока бутанольная фаза не перестанет флуоресцировать в длинноволновом УФ свете.
14. Перенесите водную фазу в диализный мешок и диализуйте против 100 объемов буфера ТЕ в течение 16 ч при 4 °С. Буфер следует заменять по меньшей мере дважды.
15. Отберите раствор ДНК из диализного мешка и осадите ДНК этанолом, как описано в пп. 12 и 13, табл. 4. Растворите осадок ДНК в дистиллированной воде; объем раствора можно довести до 500 мкл.
') Раствор для заполнения центрифужных пробирок: 52 г CsCl; 52 мл ТЕ; 2 мл раствора этидиумбромида (10 мг/мл).
272
Глава 2
1
тает. Он также эффективен при работе с организмами, рбдст-венными Streptomyces, например проактиномицетами, длй которых первый метод не дает хороших результатов.
4.2.2. Плазмидная ДНК
В литературе описано несколько методов выделения плазмидной ДНК: лизис щелочью в присутствии SDS, лизис тритоном и т. д. Мы обычно используем метод (табл. 6), основанный на ранних методических разработках по выделению и очистке SCP2 [24]. Хотя вся процедура выделения занимает два дня, она включает довольно простые операции и дает легковоспроизводимые результаты. Выход плазмидной ДНК составляет приблизительно 2 мг для высококопийных векторов типа pIJlOl, что вполне пригодно для получения препаративных количеств вектора.
Мицелии лизируют в растворе SDS (см. этап 4, табл. 6). Полный лизис на этой стадии •— залог высокого выхода плазмидной ДНК. Лизаты некоторых штаммов содержат столь большие количества РНК, что ее осадок на стенке центрифужной пробирки при кручении в вертикальном роторе может загрязнить полосу плазмидной ДНК. Чтобы этого избежать, добавляют РНКазу (100 мкг/мл, 50 °С, 30 мин) к надосадоч-ной жидкости на стадии 5.
Быстрый скрининг клонов целесообразно проводить, выделяя плазмидную ДНК непосредственно из колоний [29].
4.2.3. Фаговая ДНК
Наша лаборатория не имеет приоритета на выделение ДНК актинофагов, поэтому было бы неуместно приводить здесь соответствующие методики. Заметим только, что в своей работе мы с успехом использовали фаговую ДНК, предоставленную Чейтером; эта ДНК была выделена по методике, описанной им с сотрудниками [25]. ДНК актинофагов выделять несколько сложнее, чем плазмидную ДНК актиномицетов, аналогично тому как ДНК фага лямбда выделять труднее, чем плазмидную ДНК из клеток Е. coli.
4.2.4. Обработка ДНК-вектора фосфатазой
Для увеличения числа клонов, содержащих вставки, в процессе приготовления любого банка генов рекомендуется провести фосфатазную обработку вектора, чтобы предотвратить ковалентное соединение его концов друг с другом (без вставки) в ходе реакции лигирования. Этот подход используют как для плазмидных, так и для фаговых векторов. Дефосфорилирование
¦V
Клонирование генов в стрептомицетах
273
векторов осуществляют с помощью фосфатазы из тонкого кишечника теленка (Boehringer).
ДНК вектора, обработанную рестриктазой, осаждают этанолом, высушивают в вакууме и растворяют в 0,1 М глицине (pH 10,2) до концентрации 100 нг/мкл. Добавляют щелочную фосфатазу (0,5 ед/мкг ДНК) и инкубируют при 37 °С в течение 60 мин. Реакцию останавливают, добавляя равный объем фенола; смесь встряхивают и центрифугируют в микроцентрифуге. Водную фазу несколько раз экстрагируют хлороформом, затем переносят в новую микроцентрифужную пробирку и осаждают ДНК этанолом, чтобы сконцентрировать для последующего лигирования.
Высокое значение pH инкубационной смеси близко к оптимальному для данного фермента, поэтому в реакцию добавляют минимальное количество фосфатазы. Присутствие в смеси небольшого количества (NH4)2S04, который содержится в коммерческих препаратах фосфатазы, не оказывает влияния на эффективность лигирования. Щелочная фосфатаза должна иметь квалификацию «для молекулярно-биологических исследований» («Molecular biology grade», Boehringer). Такой препарат хорошо работает в буфере для рестриктазы и не содержит (NH4)2S04.
