Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
3. Двухвалентные катионы. R2 содержит 50 мМ Mg2+ и 20 мМ Са2+. Изменяя соотношение этих катионов в интервале 0—100 мМ, можно повысить эффективность трансформации некоторых штаммов.
4. Содержание фосфата. R2 содержит 0,005% КН2Р04. Некоторые штаммы требуют более высокого уровня фосфата в среде
280
Глава 2
для оптимальной регенерации. Испробуйте различные концентрации вплоть до 0,025%.
5. Пролин в среде R2 присутствует. Для большинства штаммов он не является необходимым компонентом. В то же время другие аминокислоты, например аспарагин, могут повысить эффективность регенерации ^охарактеризованного штамма или обеспечить его более активную споруляцию.
Время, которое требуется протопластам различных штаммов для полной регенерации, варьирует от трех дней до нескольких недель. Если данный штамм нуждается в длительной инкубации, следует загерметизировать чашки, обмотав их по окружности липкой лентой, чтобы избежать чрезмерного подсыхания агара.
Некоторые штаммы лучше регенерируют при температурах, несколько отличающихся от тех, которые считаются оптимальными для выращивания. Тем не менее начинать следует с температуры 30 °с.
4.7. Идентификация/селекция трансформантов
4.7.1. Плазмиды, экспрессирующие «летальный зигозис»
Идентификацию трансформантов в случае плазмид, не содержащих селективных маркеров (таких, например, как детерминанты лекарственной устойчивости), обычно осуществляют, используя феномен летального зигозиса (lethal zygosis) [25]. На чашке, покрытой сплошным слоем регенерирующих протопластов, трансформанты выглядят как «оспины» (прозрачные зоны) на газоне нетрансформированных бактерий. Биологические основы этого явления, получившего название «летального зигозиса», неясны.
При большом разведении протопласты регенерируют как одиночные колонии. Когда начинается споруляция, с чашки делают реплику на газон клеток, не содержащих плазмиду. При подращивании чашки-реплики трансформанты формируют на газоне «оспины».
4.7.2. Плазмиды, имеющие селективный маркер
Большинство разработанных в последнее время векторов для молекулярного клонирования в стрептомицетах имеет по крайней мере одну детерминанту лекарственной устойчивости, которая позволяет осуществлять селекцию трансформантов. Маркеры лекарственной устойчивости генетически доминантны. Чаще всего они кодируют ферменты, которые либо 1) модифицируют мишень данного лекарственного препарата, либо 2) химически
Клонирование генов в стрептомицетах
281
модифицируют молекулу самого лекарственного агента таким образом, что последний становится неэффективным. К первой группе можно отнести детерминанты устойчивости к тиостреп-тону и эритромицину, обусловливающие специфическое метилирование хозяйских рибосом, которое блокирует присоединение к ним этих агентов. Представителями второй группы являются детерминанты устойчивости к виомицину и неомицину, кодирующие фосфотрансферазы, которые инактивируют эти вещества, делая их неспособными связываться с соответствующими мишенями.
После трансформации требуется определенное время для того, чтобы ферменты, ответственные за лекарственную устойчивость, накопились в клетке в достаточном количестве и обеспечили экспрессию соответствующего фенотипа. Следовательно, если трансформированные протопласты немедленно высеять на среду, содержащую антибиотик, они погибнут. Поэтому протопласты высевают на регенерационную среду без антибиотика, где в неселективных условиях регенерируют как трансформированные, так и нетрансформированные протопласты. Затем к регенерационной среде добавляют антибиотик: нетрансформированные протопласты погибают, а трансформанты выживают и развиваются в зрелые колонии. Антибиотик можно внести в мягкий регенерационный агар (0,6% R2) и залить таким агаром поверхность регенерационной чашки. Однако часто этот метод вызывает затруднения при отборе колоний, что делает практически невозможным приготовление реплик для повторного скрининга (колонии оказываются погруженными в агар). Альтернативным способом добавления антибиотика является следующий. Антибиотик растворяют в 1 мл 0,3 М сахарозы, выливают раствор на чашку и, держа ее наклонно, поворачивают до тех пор, пока раствор не смочит всю поверхность агара. Сахароза впитывается в агар за 1—2 сут последующей инкубации при 30 °С. Инкубатор должен быть установлен строго горизонтально, иначе раствор антибиотика стечет на край чашки, и тогда в этой зоне погибнут даже трансформанты; в то же время на остальной поверхности концентрация антибиотика будет столь низкой, что нетрансформированные протопласты будут продолжать расти.
Обычно для селекции трансформантов используют следующие концентрации антибиотиков (из расчета 1 мл раствора на чашку): тиострептон — 200 мкг/мл; эритромицин — 200 мкг/мл; неомицин—10 мкг/мл; виомицин — 200 мкг/мл. Время внесения антибиотика нужно подбирать для каждого штамма индивидуально. Так, к протопластам S. lividans антибиотик добавляют через 18—24 ч после высева, тогда как протопласты S. rimosus требуют 24—28 ч роста в неселективных условиях. Для штаммов, протопласты которых полностью регенерируют за три не-
