Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
9. Отберите вязкий слой и перенесите в стерильный стакан на 100 мл. Аккуратно прилейте равный объем изопропанола, так чтобы образовались две фазы. ДНК, преципитировавшую в интерфазе, намотайте на пастеровскую пипетку.
10. Растворите ДНК в минимальном объеме ТЕ. Для того чтобы полностью растворить ДНК, можно нагреть раствор до 65 °С.
11. Добавьте РНКазу до конечной концентрации 20 мкг/мл. Инкубируйте при 50 °С в течение 1 ч.
12. Добавьте протеиназу К (свежеприготовленный раствор) до конечной концентрации 100 мкг/мл, NaCl и SDS — до концентрации соответственно 100 мМ и 0,4%. Инкубируйте при 37СС в течение 1 ч.
13. Добавьте равный объем фенола, насыщенного ТЕ, и повторите стадии 5—10.
14. Определите концентрацию и чистоту ДНК по ее спектру поглощения в интервале длин волн 230—280 нм.
1. Первый метод (табл. 3) подходит для большинства штаммов. Он включает процедуру «наматывания» высокомолекулярной ДНК из раствора, что обеспечивает ее эффективную очистку. Успех всей процедуры зависит от полноты лизиса клеток додец ил сульфатом натрия (SDS) на стадии 4. Перемешивать следует тщательно, но нерезко, чтобы избежать фрагментирования высокомолекулярной ДНК. Фенол надо добавлять немедленно, чтобы предотвратить действие нуклеаз, которые высвобождаются в момент лизиса клеток.
Обычно этим методом получают до нескольких миллиграммов ДНК, что вполне достаточно для проведения многих экспериментов. Хотя эта процедура может показаться скучноватой, она обеспечивает получение высокомолекулярной ДНК (>100 т.п.н.) отличного качества и, безусловно, оправдывает затраченные время и усилия.
2. Ускоренный метод выделения тотальной ДНК (табл. 4) включает лизис мицелия SDS и очистку ДНК путем центрифугирования в градиенте плотности CsCl. Преимущество этого метода — относительная простота, но, к сожалению, применять его можно не для всех штаммов. Случается, что ДНК после центрифугирования оказывается частично деградированной — вероятно, из-за действия ДНКаз, которые высвобождаются на стадии 4. Для того чтобы инактивировать нуклеазы, на этой стадии можно добавить фенол (см. этапы 4—8, табл. 3), но это увеличит количество операций. Если экспериментатор все же решит добавлять фенол, ему стоит подумать, какой методике —
Клонирование генов в стрептомидетах_____________________269
Таблица 4. Ускоренная процедура выделения суммарной ДНК стрептомицетов (метод //)
1. Внесите в 25 мл среды TSB или YEME (в зависимости^ от штамма — см. текст) 0,1 мл концентрированной суспензии спор. Инкубируйте на качалке при 30 °С.
2. Осадите клетки, когда культура достигнет заметной плотности (обычно для этого требуются 2 дня), путем центрифугирования в 50 мл стакане в роторе Beckman JA20 (или эквивалентном) при 10000 об/мин (12 000 g) в течение 10 мин.
3. Ресуспендируйте осадок клеток в 25 мл буфера ТЕ, добавьте 25 мг лизоцима и инкубируйте при 30 °С в течение 15 мин.
4. Добавьте 1,25 мл 20%-ного раствора SDS. Раствор станет вязким. Добавьте 26,25 г CsCl, аккуратно перемешивая смесь, и 1 мл этидиумброми-да (10 мг/мл в ТЕ). Конечная плотность раствора должна быть 1,58 г/мл.
5. Перелейте раствор в центрифужную пробирку для ротора Beckman VTi50 (или эквивалентного). Заполните пробирку доверху подходящим раствором CsCl или минеральным маслом (см. табл. 6, этап 8) и закройте крышкой, руководствуясь инструкцией.
6. Проведите равновесное центрифугирование. Для ротора VTi50 рекомендуемый режим: 16 ч при 45 000 об/мин, 20 °С.
7. Визуализируйте ДНК длинноволновым УФ светом. Отберите полосу, соответствующую хромосомной ДНК, с помощью шприца и широкой иглы, проколов боковую стенку пробирки. Разведите ДНК в три раза буфером ТЕ и осадите этанолом (2,2 объема).
8. После 1-часового выдерживания при —20 °С соберите осадок ДНК центрифугированием. Подсушите осадок на воздухе и растворите ДНК в минимальном объеме ТЕ.
табл. 3 или табл. 4 — следовать дальше. В целом же, это дело вкуса. Выход ДНК в среднем составляет приблизительно 100 мкг на 25 мл культуры. Полученную этим методом ДНК лучше всего использовать для блот-гибридизации по Саузерну, где незначительная деградация материала не играет существенной роли.
3. Некоторые штаммы дают низкий выход ДНК, которая к тому же оказывается полностью деградированной, если использовать любой из описанных выше методов. В этом случае может помочь механическое разрушение мицелия в жидком азоте с последующей экстракцией саркозилом (табл. 5). После обработки РНКазой и протеиназой К лизат наслаивают на градиент плотности CsCl (не содержащий этидиумбромида, плотность 1,7 г/мл) для дальнейшей очистки. Этот метод позволяет получать высокомолекулярную ДНК хорошего качества, однако в весьма небольших количествах (обычно менее 50 мкг). Проблему низкого выхода можно преодолеть, нарастив несколько литров культуры и пропорционально увеличив количественные параметры, приведенные в табл. 5 (в частности, использовать все восемь пробирок в роторе для ультрацентрифугирования). Таким образом, этот метод можно рассматривать как хороший запасной вариант на тот случай, если первый метод не срабо-
