Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 129

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 123 124 125 126 127 128 < 129 > 130 131 132 133 134 135 .. 253 >> Следующая

Клонирование в дрожжах
289
Таблица 1. Распространенные бактериальные и дрожжевые штаммы, используемые в молекулярном клонировании
Штамм Генотип Ссылка
А. С600 К12 leuB6 thi-1 thr-1 [4, 21]
Бактерии lacYl ton A21 supE44 [5]
hisB463 К12 hisB463 ksdR+ hsdM+
trpC9830 К12 W3110 trpC117 [22, 23]
DB6656 К12 pyrF: '.Mu trpaml^cZsm [19]
hsdR~ hsdM+
ВА1 К12 leuB6 trpC1117 hisB463 Э. Мюррей (лич
TnlO: -.near hisB thr thi ное сообщение)
thyA strT hsdR~ hsdM~
Б. LL20 MAT а leu2-3,112 his3-11,15 [24]
Дрожжи YNN281 MAT а his-ЗА trpl-h tira.3-52 Р. Дэвис (личное
ade2-101 lys2-801 сообщение)
SR25-1A Mata his4-912 ura3-52 Ш. Рёдер (личное
сообщение)
W301-18A Mata ade2-l trpl-1 [25]
Ieu2-3J12
his3-ll,15 ura3-l can-100
ного клонирования в дрожжах. Они должны содержать соответствующие генетические маркеры для селекции трансформантов и дрожжевую область начала репликации для обеспечения высокоэффективной трансформации, а также бактериальные генетические маркеры и область начала репликации для селекции и размножения в Е. coli. Вводя в вектор случайные фрагменты дрожжевой ДНК, получают библиотеку клонов. Отбор рекомбинантов по комплементации осуществляется двумя способами. Один из них предполагает прямую селекцию по интересующему маркеру сразу после трансформации. Другой предусматривает первоначальную селекцию библиотеки по комплементации дрожжевого маркера, присутствующего во всех плазмидах, а затем — скрининг (или селекцию) трансформантов на комплементацию интересующего гена. Первая схема оправдана только в том случае, если интересующий ген характеризуется очень низкой частотой реверсий (менее чем 10~8). Если частота реверсий выше, на чашках появится достаточно большое количество ревертантов, которые могут ввести в заблуждение при отборе клонов. Согласно второй схеме, сначала проводится селекция клонов с использованием генетического маркера, присутствующего в векторе и обладающего низкой частотой реверсий; это позволяет контролировать стадию трансформации. Затем трансформанты скринируют (или проводят их селекцию) на комплементацию интересующего гена. При использовании маркеров ауксотрофности селекция трансформантов осущест-
19—196
290
Глава 3
вляется просто — путем приготовления реплик на соответствующей среде. Если фенотипическое выражение интересующего гена отлично от простой ауксотрофии, комплементационные тесты соответствующим образом видоизменяются. Например, ген радиационной чувствительности можно выявить, тестируя трансформанты на устойчивость к радиации [26]. В зависимости от типа библиотеки для обнаружения комплементи-рующего фрагмента необходимо провести скрининг от 1000 до 20 000 клонов.
Клонирование дрожжевых генов с использованием комплементации в целом оказалось довольно удачным методическим приемом. Однако известны два примера, когда определенные фрагменты дрожжевой ДНК не удалось обнаружить в библиотеках, полученных на основе плазмидных векторов и размноженных в Е. coli. Так, Кэрол Ньюлон с сотрудниками в процессе «прогулки» по хромосоме III не смогла найти клон, который перекрывался бы с двумя уже охарактеризованными фрагментами (личное сообщение). Тогда она попыталась клонировать этот промежуточный фрагмент, используя метод заполнения бреши (gap repair): прилежащие последовательности должны были обеспечить гомологичное спаривание (см. разд. 4.2). Оказалось, что содержащие интересующий фрагмент бактериальные субклоны довольно плохо растут; это навело на мысль, что изначальная неудача с его клонированием в Е. coli объясняется «недопредставленностью» этого фрагмента в первичной библиотеке. Гейбер и Финк столкнулись с трудностями при попытке выделить дрожжевой ген holl из плазмидной библиотеки (личное сообщение). Им пришлось сконструировать дрожжевую библиотеку in vitro и выделять нужный клон после прямой трансформации ею соответствующим образом маркированного штамма дрожжей. Анализ субклонов показал, что последовательность, прилежащая к гену holl, сильно замедляет рост содержащих ее бактериальных колоний.
Чтобы удостовериться в том, что функция комплементации задана плазмидой, надо показать, что в клетках, спонтанно утративших плазмиду, наблюдается одновременная утрата интересующего фенотипа и селективного маркера, общего для всех трансформантов. Спонтанную утерю плазмиды можно обнаружить, высеяв 500—10 000 колоний (приблизительно по 500 колоний на чашку) и сделав реплики на среду, первоначально использовавшуюся для селекции трансформантов. Отсутствие плазмиды выражается в неспособности расти на селективной среде. Утратившие плазмиду клоны затем тестируют на комплементацию интересующего гена. Число колоний, которое необходимо проанализировать, чтобы найти клон, утративший плазмиду, зависит от стабильности плазмиды. Некоторые плазмиды, содержащие центромерные области, настолько стабильны,
Предыдущая << 1 .. 123 124 125 126 127 128 < 129 > 130 131 132 133 134 135 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed