Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Сначала конструируют библиотеку клонов кДНК, полученной на основе суммарной мРНК (прежде чем приступать к клонированию, целесообразно обогатить препарат суммарной мРНК интересующими транскриптами). Затем выделяют ДНК инди-
Клонирование в дрожжах
287
видуальных клонов и гибридизуют с тотальной клеточной мРНК После гибридизации несвязавшуюся мРНК транслируют in vitro и продукты трансляции анализируют на присутствие интересующего белка. Клон, ДНК которого при гибридизации с суммарной мРНК делает ее неспособной направлять синтез ожидаемого белкового продукта, и есть искомый клон. Альтернативный вариант эксперимента предполагает транслирование in vitro связавшейся РНК и соответствующий анализ полученных продуктов [14].
Ген, белковый продукт которого получен в очищенном виде, можно обнаружить и выделить с помощью антител к этому продукту. Антитела можно использовать и для детектирования перекрестно реагирующего материала (ПРМ), экспрессирующегося в гетерологичной системе, например Е. coli. Так, ген гек-сокиназы был выделен из банка клонов дрожжевой ДНК путем фиксации тотального белка каждой бактериальной колонии на пластиковой подложке и последующего скрининга на ПРМ методом радиоиммунного анализа с использованием антител к гек-сокиназе [10]. Позитивный сигнал указывал на присутствие в ДНК соответствующего клона искомого фрагмента, который обеспечивает синтез данного белка в клетках Е. coli. Не так давно был разработан новый фаговый вектор ^gtll, который специально предназначен для конструирования экспрессируемых библиотек, скринируемых антителами. В этом векторе был клонирован ряд генов дрожжей, включая гены нескольких субъединиц РНК-полимеразы [12] и ДНК-топоизомеразы [13]. Полное описание этой системы молекулярного клонирования можно найти в гл. 2 первого тома данной книги.
2.4. Клонирование с использованием перекрестной гибридизации
Эволюционно консервативные гены других видов можно использовать в качестве тест-проб для поиска гомологичных генов в геномных банках дрожжей. Этим методом были идентифицированы гены гистонов [54], гены некоторых гликолити-ческих ферментов [15], а также протоонкогены [16]. Техника подобного эксперимента несложна. Сначала приготавливают геномный блот и тестируют его в условиях различной жесткости на наличие перекрестной гомологии. Подобранные на этой стадии условия гибридизации используют затем при скрининге фаговой или плазмидной библиотеки. Получение позитивного сигнала предполагает дальнейшее уточнение природы клонированного гена с помощью анализа первичной структуры ДНК, а также решение вопроса о том, является ли данный ген функционально активным в геноме дрожжей.
288
Глава 3
2.5. Клонирование с использованием комплементации
в Е. coli
Фрагменты ДНК дрожжей, кодирующие ферменты некоторых биосинтетических процессов, впервые были выделены с использованием феномена комплементации ауксотрофных мутаций Е. coli. Так, например, штамм Е. coli, имеющий аллель 1еиВ, ревертирующий к дикому типу с низкой частотой (эта мутация затрагивает один из генов биосинтеза лейцина), трансформировали дрожжевой ДНК, введенной в соответствующий бактериальный вектор [4J- Трансформантов выращивали на селективной среде, содержащей антибиотик, устойчивость к которому обеспечивал соответствующий ген вектора, и затем скриниро-вали полученный банк, используя в качестве критерия способность клонов расти на среде без добавления лейцина. Было отобрано несколько клонов, содержащих общую последовательность ДНК дрожжей. Клонированная последовательность ком-плементировала мутацию Е. coli благодаря тому, что включала соответствующий дрожжевой ген биосинтетического пути лейцина LEU2. Это было подтверждено результатами дальнейшего анализа клонированного гена [6, 17], в частности генетического картирования и определения первичной структуры ДНК [18]. Подобным же образом благодаря комплементации соответствующих мутаций Е. coli были выделены и некоторые другие дрожжевые гены, в том числе HI S3 [5], URA3 [19] и TRP1 [20]. Эти гены нашли в дальнейшем широкое применение при конструировании векторов для молекулярного клонирования в дрожжах.
При конструировании векторов, содержащих эти гены, удобно использовать бактериальные штаммы, которые несут мутации, комплементируемые данными генетическими маркерами. Идентификация правильной конструкции в этом случае легко осуществляется по результатам простого комплементационного теста. Некоторые распространенные бактериальные штаммы, используемые в подобных тестах, приведены в табл. 1.
2.6. Клонирование с использованием комплементации
в дрожжах
Клонирование генов с использованием феномена комплементации мутаций у дрожжей предполагает наличие геномной библиотеки дрожжей дикого типа в векторе, способном с высокой эффективностью трансформировать дрожжевые клетки. О конструировании дрожжевых векторов и их использовании будет подробно рассказано в разд. 3.1. Здесь мы лишь перечислим общие требования, предъявляемые к векторам для молекуляр-
