Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
3. Ресуспендируйте клетки в 1,5 мл 0,1 М LiCl (или 0,3М LiOAc), приготовленного на буфере ТЕ, и инкубируйте при 4 °С в течение 3—8 ч.
4. Отберите в пробирку с крышкой 200 мкл суспензии для трансформации и добавьте ДНК в количестве 1—10 мкг. Постарайтесь, чтобы объем добавляемой ДНК. не превышал 1/10 объема реакционной смеси. Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 30 мин, периодически мягко помешивая содержимое пробирки.
5. Тщательно ресуспендируйте клетки, добавьте 1,5 мл 40%-ного PEG 4000 и перемешайте, перевернув пробирку. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч.
6. Поместите клетки на 5 мин в баню с температурой 42 °С.
7. Центрифугируйте при 1500 об/мин в течение 7 мин. Промойте дважды осадок водой путем его повторного мягкого ресуспендирования и центрифугирования.
8. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл воды и высейте на подходящий минус-агар1».
*) Рецептура сред приведена в табл. 5.
2) ТЕ: 10 мМ трис*НС1 pH 7,4; 1 мМ ЭДТА.
В заключение упомянем еще одну процедуру трансформации, основанную исключительно на использовании полиэтиленглико-ля (PEG 1000) [39]. Принципиальным моментом здесь является очистка PEG для удаления примесей, снижающих эффективность трансформации. Следует отметить, что эффективность трансформации как сферопластов, так и «литиевых» клеток зависит от партии PEG 4000 [40]. Мы пришли к выводу, что, подобрав хорошую партию PEG, можно значительно увеличить выход трансформантов.
3.3. Среды для культивирования дрожжей
Дрожжевые клетки растят на богатых средах. В качестве источника углерода чаще всего используют глюкозу, хотя здесь возможно большое разнообразие вариантов. В табл. 5 приведены некоторые наиболее употребимые среды для выращивания дрожжей. Продолжительность одной генерации для стандартного штамма составляет в среднем 60—90 мин (в жидкой среде YPD при 30°С). Для получения ночной культуры клетки обычно вносят в среду в таком количестве, чтобы титр исходной культуры составлял 5-104/мл.
Твердые среды приготавливают на основе жидких, добавляя агар до концентрации 2%. Синтетическая среда без добавочных питательных веществ (минимальная среда) может применяться
298
Глава 3
Таблица 5. Среды для культивирования дрожжей
Тип среды
Название
Состав
Богатая среда
Богатая среда (не-сбраживаемый источник углерода) Синтетическая среда
Полная синтетическая среда
Минус-среда
Регенерационный
агар
YPD
YPG
SD
СОМ
СОМ-метаболит. Обычно называется просто «—» метаболит (например, СОМ — URA обозначают как —URA, что значит «минус—урацил») RA-метаболит
1% Дрожжевой экстракт 2% Пептон 2% Декстроза 1 % Дрожжевой экстракт 2% Пептон 3% Глицерин
0,17% Дрожжевые азотистые основания без аминокислот и сульфата аммония
0,50% Сульфат аммония 2% Декстроза
SD, содержащая по 20 мкг/мл аденинсульфата, Ь-аригинин-НС1 Ь-гистидин-НС1, L-метионина, L-триптофана и урацила; по 30 мкг/мл L-изолейцина, L-лизин-НС1 и L-тирозина; 50 мкг/мл L-фенилаланина; 60 мкг/мл L-лей-цина; 150 мкг/мл L-валина СОМ — минус один (или более) метаболит (ов)
SD, содержащая 1 М сорбитол плюс 0,5% YPD; необходимые добавки в концентрациях, указанных для СОМ и 3% агар
Примечание: твердые среды готовят на основе жидких, добавляя агар до 2%.
для культивирования дрожжей дикого типа. Для культивирования ауксотрофных мутантов в синтетическую среду следует внести либо только те метаболиты, которые необходимы данному штамму, либо все двенадцать основных метаболитов (полная среда). Если в лаборатории постоянно работают с одним штаммом или с ограниченным их набором, удобнее использовать минимальную среду, дополненную метаболитами в соответствии с потребностями данного штамма. Если же в работе находится много штаммов, можно приготовить среду с «пропусками». «Пропуски» подразумевают отсутствие в среде одного из двенадцати основных метаболитов, вследствие чего такую среду называют также средой «минус метаболит» или минус-средой. Фенотип штамма можно определить путем переноса одной пробной колонии на различные минус-среды: ауксотрофность про-
Клонирование в дрожжах
299
явится в неспособности клеток расти на какой-нибудь одной из них.
Селекция по комплементации маркера ауксотрофности после трансформации осуществляется с помощью подходящей минус-среды. Метод трансформации сферопластов предусматривает регенерацию их в осмотически стабилизированной синтетической среде (табл. 5). В регенерационный агар вносят те же добавки, что и в селективную среду. Например, трансформантов с фенотипом LEU+ отбирают на среде без лейцина, помещая их в регенерационный агар, не содержащий этой аминокислоты. Если проводят трансформацию «литиевых» клеток, их высевают непосредственно на подходящую селективную синтетическую среду.
3.4. Гибридизация колоний
Проведя селекцию трансформантов, желательно удостовериться в том, что плазмидная ДНК действительно присутствует в дрожжевой клетке. Это особенно важно для некоторых процедур «спасения» аллеля, описанных в разд. 4.3. Обнаружение плазмидных (векторных) последовательностей значительно облегчается, если использовать метод гибридизации дрожжевых колоний [6], который основан на аналогичном методе, разработанном для бактериальных колоний [41]. Радиоактивный зонд приготавливают с использованием методов смещения одноцепочечных разрывов (ник-трансляция) или концевого мечения. Дрожжевые колонии выращивают в течение 24 ч на 85 мм фильтре, помещенном на чашку с YPD-агаром, затем этот фильтр обрабатывают по следующей схеме.
