Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
11. К надосадочной жидкости добавьте 12 мл 95%-ного этанола, перемешайте и центрифугируйте при 15 000 об/мин в течение 15 мин при комнатной температуре, как описано в пункте 2. Удалите надосадочную жидкость и осадок высушите на воздухе.
12. Ресуспендируйте осадок в 3 мл ТЕ. Если раствор содержит нерастворимые частицы (остатки клеток), удалите их центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 10 мин, как описано в пункте 2.
13. Перенесите раствор в 14 мл полипропиленовую пробирку, добавьте 150 мкл раствора панкреатической РНКазы (1 мг/мл) и инкубируйте при 37 °С в течение 30 мин.
14. Экстрагируйте раствор смесью фенол, хлороформ, изомиловый спирт (25 : 24 : 1).
15. Верхнюю фазу отберите, доведите концентрацию соли в ней до 0,3 М и добавьте 2 объема холодного 95%-ного этанола. Перемешайте и оставьте при —20 °С на 2 ч или на более продолжительное время.
16. Осадите ДНК путем центрифугирования при 10 000 об/мин, 4 °С в течение 30 мин (см. пункт 2).
17. Удалите надосадочную жидкость, осадок высушите на воздухе и растворите в 0,5 мл ТЕ.
ДНК недавно предложен в лаборатории Дэвиса [45]. Приведенная здесь методика (табл. 6) основывается на аналогичной процедуре и позволяет получить приблизительно 10—50 мкг ДНК из 40 мл культуры дрожжей. Количественные параметры всей схемы можно пропорционально уменьшить с таким расчетом, чтобы выделять ДНК из 5 мл культуры — полученной ДНК
302
Глава 3
будет достаточно для большинства процедур. Эти препараты ДНК можно использовать и при наработке плазмид.
Автономно реплицирующиеся плазмиды удобно нарабатывать путем непосредственной трансформации бактериальных клеток выделенной дрожжевой ДНК [8]. Обычно 100—300 нг суммарной дрожжевой ДНК в зависимости от компетентности бактериального штамма и копийности плазмиды позволяют получить от 100 до 300 трансформантов. Лучше всего трансформировать компетентные бактерии (200 мкл сконцентрированных в 20 раз клеток, полученных из культуры с ОП600 = 0,6) не более чем 300 нг суммарной ДНК, поскольку количество трансформантов уменьшается в присутствии большого избытка ДНК. Интегрированные плазмиды нарабатывают следующим образом. Расщепляют суммарную дрожжевую ДНК ( — 300 нг) подходящей рестрицирующей эндонуклеазой (см. разд. 4.2). Реакционную смесь разбавляют до 1 мл и инкубируют с АТР и ДНК-лигазой Т4 в течение ночи при 15 °С [8]. Затем этой ДНК трансформируют компетентные бактериальные клетки ("8]; результат будет приблизительно таким же, как в случае автономных плазмид.
4. Манипулирование с клонированными ДНК
В некоторых случаях, после того как фрагмент ДНК идентифицирован, для изучения экспрессии гена возникает необходимость ввести его обратно в геном. Мы обсудим несколько способов введения фрагментов ДНК в специфические участки хромосом. Описанные методы можно использовать в целях пре-селекции участков интеграции для плазмид, содержащих множественные дрожжевые последовательности, для «спасения» аллеля, в процедурах «нарушения гена» и замещения гена. Все эти методы основываются на гомологичной рекомбинации между вводимой ДНК и дрожжевой хромосомой.
4.1. Направленная интеграция плазмид
Описан эффективный метод введения плазмид в геном дрожжей путем стимулирования гомологичной рекомбинации [24]. Этот метод использует способность дрожжей репарировать двухцепочечные разрывы в ДНК для инициации рекомбинационных процессов с участием геномной ДНК и вводимых линейных фрагментов. В том случае, когда плазмида содержит две или большее число областей гомологии с геномной ДНК, в середину той зоны, которая гомологична интересующему геномному сайту, вносят двухцепочечный разрыв с помощью рестрицирующей эндонуклеазы. Линеаризованные таким образом молекулы вводят в дрожжевые клетки, трансформируя штаммы, несущие со-
Клонирование в дрожжах
303
ответствующие генетические маркеры. Трансформацию проводят либо со сферопластами, либо с «литиевыми» клетками [6, 7, 38]. Обычно 1—10 мкг ДНК хватает, чтобы получить от нескольких единиц до нескольких тысяч трансформантов в расчете на 107 клеток. Трансформантов, содержащих плазмидную ДНК, идентифицируют с помощью гибридизации колоний, после чего можно приступать к выделению ДНК из «положительной» колонии [6]. Затем проводят геномную блот-гибридизацию для уточнения сайта интеграции и выяснения, не имела ли место множественная тандемная интеграция плазмид в данный участок генома [24].
4.2. Методы «спасения» аллеля
Генетические исследования часто выдвигают задачу клонирования мутантных аллелей интересующего гена. Если уже клонирован фрагмент ДНК, содержащий ген дикого типа, относительно несложно получить клоны, несущие его мутантные аллели. Один из подходов основан на использовании гомологичной рекомбинации между геном дикого типа, находящимся в составе плазмиды, и мутантным геном на хромосоме для введения поблизости от интересующего аллеля векторной последовательности (рис. \,А). Вследствие дупликации последовательности в месте интеграции мутантный аллель оказывается расположенным по одну сторону вектора, а аллель дикого типа— по другую. Поскольку точная топография рекомбинантной области неизвестна (она зависит от того, в каком месте относительно мутантной области произошел интегративный кроссин-говер), «извлечение» интересующей мутантной последовательности требует независимого клонирования каждой из дуплицированных копий, фланкирующих вектор. В примере, представленном на рис. \,А, следующим шагом будет выделение двух самостоятельных плазмид с помощью независимого расщепления геномной ДНК двумя рестриктазами, специфичными к участку а и к участку d. После рестриктазной обработки ДНК лигируют, трансформируют ею Е. coli и затем выделяют обе плазмиды, как это описано в разд. 3.5.
