Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Штаммы A. tumefaciens
А136 С58rifT, не содержащий Ti-плазмиду [20]
LA4404 А136, содержащий pAL4404 [22]
GV3102 Эквивалент А136 [9]
Плазмиды
pBR322 Арг, Тс1 [15]
pGJ28 KmT, NtnT, Сda+, Ida+, СоШ-репликон, несущий
[18]
R64drdll Tcr, SmT; трансмиссибельная плазмида la-типа,
дерепрессированная производная R64 [18]
pGV3850 Арт опс--производная нопалиновой плазмиды [9]
pGC3839, содержащая последовательности
pBR322
pAL4404 Производная октопиновой плазмиды pTiAch5, [22]
имеющая делецию области Т-ДНК
pLGVneoI 103 Apr, Km1, производная pBR322 с гибридным ге [14]
ном nos-neo
pRK2013 Km1 ColEI-производная РК2 с fra-генами [23]
pGV2215 KmT, tms-мутант Ti-плазмиды октопинового типа
pTiB653 [16]
pGV3851 Арт, tms~-производная нопалиновой. Ti-плазмиды [16]
С48, содержащая последовательности pBR322
pMP61 Производная pGV3105 Тгас посс осс+ с инсер-
цией рНС79 в ген nos [17]
pHC79 Космида Арт, Тс1 |17]
ключается в следующем. Бактерии штаммов GJ23, НВ101, (pBR322::X) и GV3101 (pGV3850) выращивают согласно методике 4. Затем культуры смешивают и инкубируют для осуществления конъюгативного переноса (см. табл. 4), после чего высевают на чашки со средой АВ (табл. 1), обеспечивающей отбор GV3101 (pGV3850) и содержащей канамидин для селекции pBR322:: X.
Теперь эксконъюганты A. tumefaciens готовы для того, чтобы их анализировать на предмет коинтеграции pBR322::X и pGV3850. Соответствующие процедуры описаны в разд. 2.3. Штаммы, несущие стабильные коинтеграты, следует поддерживать на средах, содержащих нужный антибиотик.
332
Глава 4
Таблица 3. Концентрации антибиотиков, используемых
в работе с бактериями
Антибиотик Сокращение Концентрация (мкг/мл)
для клеток:
Е. coli A. tumefaci
ens
Карбенициллин сь 200 100
Хлорамфеникол Cm 30 ---
Канамицин Кп 50 50
Неомицин Nm 50 50
Рифампицин Щ 100 50
Спектиномицин Sp 100 100
Стрептомицин Sm 100 100
Тетрациклин Tc 10 2,5
Таблица 4. Конъюгация бактерий
1. При помощи стерильной зубочистки захватите одиночные колонии донорного штамма и реципиентного штамма и нарастите бактериальные культуры раздельно в 5 мл среды LBMQ*) в течение ночи на качалке до стационарной фазы. Штаммы Е. coli для конъюгации можно инкубировать в среде LB при 37 °С. Для A. tumefaciens более предпочтительна низкосолевая среда LBMG; оптимальная температура культивирования — 30 °С, так как при более высокой температуре Ti-плазмиды нестабильны.
2. Смешайте по 0,1 мл донорной и реципиентной бактериальной культуры и сконцентрируйте клетки путем фильтрации через фильтр Miilipore с размером пор 0,22 мкм.
3. Поместите фильтр на чашку со средой NA2>. Для скрещивания Е. colixE. coli чашки следует инкубировать при 37 °С в течение 4—6 ч. Для скрещивания Е. colixA. tumefaciens чашки инкубируют в течение ночи при 30 °С. (Конъюгацию Е. coli-E. coli можно проводить и на чашках с LB-агаром.)
4. Ресуспендируйте клетки с фильтра в 1 мл фагового буфера для % и высейте на подходящую селективную среду (например, на минимальную среду АВ, содержащую антибиотики для селекции эксконъюгантов и для определения титра донорных и реципиентных клеток). Эффективность переноса определяется как отношение числа эксконъюгантов к титру реципиентных клеток. Инкубируйте чашку в течение ночи при 37 °С для скрещивания Е. colixE. coli или в течение 2—3 дней при 30° для скрещивания Е. colixA. tumefaciens.
5. Отберите и рассейте штрихами на селективной среде несколько колоний эксконъюгантов, чтобы получить индивидуальные клоны. Инкубируйте чашки либо в течение ночи при 37 °С, либо в течение 2—3 дней в зависимости от вида бактерий.
') Рецептура сред приведена в табл. 1.
2) Среда NA представляет собой агаризованиую (1,5%) среду NB (табл. 1).
Генетическая инженерия растений
333
2.2.2. Конъюгативный перенос Ti-плазмид
Представляется маловероятным, чтобы этот методический прием получил сколько-нибудь широкое распространение, поскольку многие векторы на основе Ti-плазмид уже введены в соответствующие штаммы A. tumefaciens. Однако не исключена вероятность того, что появится необходимость поместить данную Ti-плазмидную конструкцию в новое геномное окружение. Так как гены tra, активность которых необходима для конъюгативного переноса Ti-плазмид, находятся под негативным контролем, их надо дерепрессировать путем добавления индуктора. Для Ti-плазмид октопинового типа индуктором является октопин, а для нопалиновых Ti-плазмид — нопалин. Индуктор дерепрессирует также опероны, обеспечивающие катаболизм каждого из этих опинов. Следовательно, трансконъюгантов можно отбирать на средах, содержащих в качестве единственного источника азота соответствующий опин. Методика конъюгативного переноса [19] подробно описана в табл. 5.
